Maresin 1减轻小鼠早期脑缺血再灌注损伤的作用与机制探讨

发布时间：2018-01-30 09:50

本文关键词： 脑缺血再灌注炎症炎症因子 MaR1 MaR1 炎症 NF-κB SIRT1 MaR1 血脑屏障 MMP9 MMP3　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分：Maresin 1 (MaRl)减轻小鼠脑缺血再灌注早期炎症性损伤目的：探讨不同剂量MaRl对小鼠脑缺血再灌注早期炎症反应的影响方法：采用线栓法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)阻断小鼠大脑中动脉起始部,1小时候后拔出线栓,模拟脑缺血再灌注。75只健康雄性C57小鼠随机分为5组(n=15)：(1)sham组：小鼠行麻醉和颈部血管分离操作与其他组相同,但不插入线栓,术后1小时侧脑室注射生理盐水2.5ul; (2) MCAO组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5ul; (3)MCAO+0.1ng MaRl组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaRl0.1ng; (4)MCAO+lngMaRl组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaRl 1ng;(5)MCAO+10ng MaR1组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaR1 10ng.再灌注后不同时间点取材,如无特殊说明,取材部位为缺血侧皮层,靠近梗死周边部分。采用TTC染色、HE染色、FJ染色、TUNEL染色评估脑梗死和组织损伤,神经行为学评分评估功能学改变,免疫荧光技术检测中性粒细胞浸润、胶质细胞激活情况,分光光度计检测脑组织中髓过氧化物酶含量。ELISA法检测脑组织中细胞因子含量,Western Blotting技术检测突触相关蛋白的表达水平。结果：MCAO组小鼠脑缺血再灌注后,与sham组小鼠相比,再灌注24小时后缺血侧有明显的梗死,染色显示有组织破坏、神经细胞空泡变性伴随炎症细胞浸润,出现较多的细胞凋亡与坏死(P0.001),再灌注48小时,72小时的神经功能有明显缺陷(P0.001),突触相关蛋白表达显著减少(P0.05)；炎症因子水平、中性粒细胞浸润和胶质细胞激活明显升高(P0.01)。MCAO术后给予MaRl 1ng可显著减小梗死体积(P0.01),保护脑组织结构与神经元,减轻细胞死亡(P0.01)与神经功能受损(P0.01)。降低炎症因子水平(P0.01),抑制胶质细胞激活和中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶释放。手术后给予0.1ngMaRl有轻微的保护作用但无统计学意义,10ngMaRl组无保护作用,各项指标与MCAO组几乎无差异。数据用均数±标准误显示,数据的分析比较采用GraphPad Prism 5.0.软件,使用单因素方差分析,两组间比较采用Student-Newman-Keuls (SNK)法,P0.05认为有统计学差异。结论：MCAO手术可成功构建脑缺血再灌注模型,各项监测指标显示缺血侧有明显的损伤梗死和炎症反应,侧脑室注射MaR1最佳剂量为1ng时,可显著减轻小鼠脑缺血再灌注早期的炎症反应,从而达减轻脑损伤。第二部分：Maresin1减轻小鼠脑缺血再灌注炎症反应的机制研究目的：研究MaRl作用于早期脑缺血再灌注炎症反应可能的机制或通路方法：线栓法建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。实验分为AB两部分,A部分30只健康雄性C57小鼠随机分为5组(n=6):(1) sham组：小鼠行麻醉和颈部血管分离操作与其他组相同,但不插入线栓,术后1小时侧脑室注射生理盐水2.5u1：(2)MCAO组：小鼠行MCA O手术,再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5u1；(3)MCAO+0.1ng MaR1组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaR1 0.1ng; (4)MCAO+1ngMaRl组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaR1 1ng; (5) MCAO+10ngMaR1组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaRl10ng。再灌注24小时施行安乐死并取材,免疫荧光技术检测核转录因子NF-kB P65亚单位在胞质胞核的分布情况,Western Blotting技术检测NF-kB P65蛋白磷酸化乙酰化水平SIRT, Bax和Be12水平,以及P65蛋白在胞核胞质的表达情况。B部分48只健康雄性C57小鼠随机分为4组(n=12)：(1)MCAO组：手术前第5天,第3天,第1天分别腹腔注射一次1%DMSO溶剂对照液,一共注射三次。小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5u1;(2) MCAO+1ng MaRl组：手术前第5天,第3天,第1天分别腹腔注射一次1%DMSO溶剂对照液,一共注射三次。小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaRl 1ng; (3) MCAO+lng MaRl+EX527组：手术前第5天,第3天,第1天分别腹腔注射一次SIRT1抑制剂EX527(5mg/kg),一共注射三次。小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaRl lng;(4)MCAO+ EX527组：手术前第5天,第3天,第1天分别腹腔注射一次SIRT1抑制剂EX527 (5mg/kg),一共注射三次。小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5u1。再灌注24小时后取材,采用TTC染色,HE染色,FJ染色评估缺血侧脑梗死体积和组织损伤,ELISA检测脑组织炎症因子TNF-α,IL-1β的含量,Western Blotting技术检测SIRT1,乙酰化(acetylation, ac)-NF-κB, Bcl2,Bax蛋白的表达水平。数据分析同第一部分结果：A部分缺血再灌注后,MCAO组小鼠Western Blotting与免疫荧光显示,核转录因子NF-κB P65入核明显增多(P0.001),P65磷酸化增多(P0.001),同时乙酰化水平增高(P0.01)。SIRT1蛋白表达下降(P0.01)。促凋亡因子Bax蛋白水平显著升高,抗凋亡因子Bc12下降(P0.01);MaRl明显抑制MCAO引起的P65的核转位(P0.001),降低p65磷酸化和乙酰化水平(P0.001),同时逆转Bax与Be12的趋势,上调SIRT1的表达。B部分实验,在MCAO造模前预注射SIRT1抑制剂EX527,再给予MaR1,与MCAO+MaRl组相比,SIRT1蛋白水平下降,乙酰化P65增多,促凋亡蛋白Bax增多抗凋亡蛋白Bc12减少；梗死体积有所增大,神经损伤加重,但仍比MCAO造模组损伤轻,MCAO+EX527组与MCAO组无明显差别。上述结果说明SIRT1抑制剂使乙酰化NF-κB增多,可部分阻断MaRl的保护作用。结论：MaR1对小鼠脑缺血再灌注早期炎症损伤的保护作用可能部分是通过SIRTI-NF-κB通路实现的。第三部分:Maresin1对小鼠脑缺血再灌注血脑屏障的影响目的：研究MaRl对小鼠脑缺血再灌注血脑屏障损伤是否有保护作用。方法：MCAO造模方法同前面部分(n=15),实验分组：(1)sham组：小鼠行麻醉和颈部血管分离操作与其他组相同,但不插入线栓,术后1小时侧脑室注射生理盐水2.5ul; (2) MCAO组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5u1-(3) MCAO+MaRl组：小鼠行MCAO手术,再灌注开始时侧脑室注射MaRl 0.1ng,或lng,或10ng。再灌注24小时取材。检测脑组织干湿重比,静脉注射依文思蓝评估血脑屏障通透性,明胶酶谱分析脑组织中基质金属蛋白酶MMP9的活性,免疫捕获技术检测MM3活性,Western Blotting技术分析zo-1,claudin5,MMP9在脑组织中蛋白表达水平,免疫荧光检测血脑屏障组成蛋白zo-1,claudin5的表达趋势与细胞定位。统计学方法同第一部分。结果：缺血再灌注处理后,缺血侧脑组织含水量明显增加(P0.001),依文思蓝渗出明显,即血脑屏障通透性增加(P0.01),基质金属蛋白酶MMP9和MMP3活性明显升高,血脑屏障组成蛋白zo-1,claudin5表达下降,MM9表达升高(P0.01),免疫荧光显示趋势大致与Western结果一致。MaRl最佳剂量为lng时,可显著降低脑缺血再灌注引起的脑水肿和依文思蓝渗出(P0.05),抑制MM9和MM3的激活,降低MMP9的蛋白表达水平(P0.01),提高血脑屏障组成蛋白zo-1,claudin5的表达(P0.01)。结论：脑缺血再灌注损伤后,MaR1可保护血脑屏障组成蛋白,抑制基质金属蛋白酶活性,从而降低血脑屏障通透性,改善脑水肿达到脑保护作用。
[Abstract]:The first part : Maresin 1 ( MaR1 ) alleviated the early inflammatory injury of cerebral ischemia / reperfusion in mice . The effect of different doses of MaR1 on the early inflammatory reaction of cerebral ischemia - reperfusion in mice was studied . The experimental results showed that the model of cerebral ischemia - reperfusion in mice was significantly decreased ( P0.01 ) . A group of 48 healthy male C57 mice were injected with 1 % DMSO solvent control solution on the 5th , 3rd , and 1st days before operation . The expression level of SIRT1 was significantly increased ( P0.01 ) . The expression level of NF - 魏B P65 increased significantly ( P0.01 ) . The expression level of MMP - 9 , MMP - 9 and MMP - 9 in brain tissue were significantly increased ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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