水蛭素的舒血管作用及机制研究

发布时间：2018-01-30 15:43

本文关键词： 平滑肌细胞 BK_(Ca) α亚单位 Hirudin HEK 293　出处：《泸州医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKca)是广泛分布在血管平滑肌的细胞(VSMCs)上的一种钾通道,其具有电导值大、对钙离子敏感、电压依赖性等特性,通道通过负反馈机制来控制平滑肌细胞肌源性张力和静息膜电位去极化程度,而BKca通道的高电导性及在平滑肌细胞上的高密度表达决定了它对血管张力的调节。通过脂质体Lipofectamine2000转染法在HEK293上转染BKCaα亚单位,用浓度为0.8mg/L G418筛选,构建稳定表达的单克隆细胞系,在该表达细胞上可以记录到与天然细胞上电生理特性相似的BKca电流。由此我们建立了BKcaa单克隆HEK293细胞模型,并在其上研究药物对该通道的作用机制。水蛭素(Hirudin, HIR)在中医上被认为有着逐瘀、通经、活血、破血功效,它是由医用水蛭唾液腺提取出的多种活性多肽组成,是一种丝氨酸蛋白酶,具有阻止血小板聚集,抗血栓形成的作用。临床上主要用于治疗脑中风,肿瘤等疾病,但活血作用在组织细胞和离子通道上鲜有报道,本实验通过观察HIR对大鼠肠系膜血管动脉张力的作用及对HEK293上转染的BKca通道作用研究,探讨其对血管作用及机制,为HIR应用于临床提供更多实验依据。方法：(1)大鼠血管环实验：用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,开腹取出肠系膜,分离出单根的肠系膜动脉,用眼科剪轻轻剔除血管上的脂肪和结缔组织,并将动脉血管剪成2-3mm的血管环,迅速放入含钙的溶液Ⅰ中,用两根银丝穿过剪好的小动脉环,确保两根银丝平行并固定在DMT的换能器上,将挂好的血管与张力换能器、生物放大器与生理记录仪连接,采用Chart7软件采集数据并进行分析,观察肠系膜血管的活性,并观察HIR对血管张力的影响以及其作用机制。(2)单通道膜片钳实验：通过脂质体Lipofectamine2000转染法转染BKca表达质粒pcDNA3.1-BKα,用0.8mg/mlG418筛选出稳定表达的单克隆细胞系进行膜片钳实验。其电流信号通过膜片放大器放大,1KHz低通进行滤波,再经12位A/D、D/A转换器输入电脑,用pClamp软件记录电流,并观察BKCa电流特征,以及HIR对BKCa电流的作用。结果：1.HIR对大鼠肠系膜动脉血管环的作用：(1)用60mM KCl5min进行预收缩两次,将引起收缩差异小于20%的血管用于后续实验。(2)用0.8μM NE去诱导血管收缩2min左右,加入25mg/L HIR可以使血管环舒张78.8±1.06%(n=5,P0.05)。(3)在0.8μM NE引起血管环预收缩,再此基础上加入25mg/L HIR,在舒张明显时加入5mMBKCa非特异性阻断剂TEA,观察到TEA对血管有收缩作用,说明HIR对大鼠肠系膜血管的舒张作用有K+通道参与。(4)当0.8μM NE引起血管预收缩后,加入不同浓度的HIR,观察血管环的舒缩变化,舒张明显时,再加入200nM BKCa通道特异性阻断剂IbTX,可引起血管收缩,其收缩百分比为7.96±1.06%,(n=3,P0.05),说明HIR对大鼠肠系膜血管的舒张作用有BKCa通道的参与。2.HIR对HEK293细胞上转染的BKCaα通道电流的作用：(1)HEK293细胞上转染的BKCaα通道的基本特征：(a) BKCaα通道的电导值：通过inside-out膜片钳记录,在140mM [K+]0/140mM [K+]i记录条件下HEK293细胞上转染的BKα通道的电导值为236.73±3.27pS(n=5)。(b)在对称性高钾溶液时,观察Ⅰ-Ⅴ曲线,曲线通过0点反转电位为0mV。(c) BKCaα通道的电压依赖性：在inside-out膜片钳记录下,膜电位从+10mV增加到+60mV时,随着膜电位的增加,该通道的电流也逐渐增大。(d) BKCaα通道的钙离子敏感性：在inside-out膜片钳记录下,随着钙离子浓度增加(0nM和111nM Ca2+),该电流明显增大。(e)在outside-out膜片下,200nM IbTX几乎可以完全阻断该通道。(2)HIR对HEK293细胞上转染的BKCaα通道电流的作用：HIR对BKCaα通道的药物依赖性,在inside-out膜片钳记录下,膜电位为+50mV时,随着HIR浓度的增加,BKCaα通道电流也随之逐渐增大。当HIR浓度从0mg/L分别增加到25、50、100、200mg/L时,BKCaα通道的开放概率分别从0.00683±0.0049增加到0.0159±0.0014(n=5,P=0.0380.05)、0.0228±0.0016(n=5,P=0.00610.05)、0.0469±0.0073(n=5,P=0.02760.05)、0.0856±0.0103(n=5,P=0.000290.01),说明HIR对稳定转染细胞系BKCaα通道电流的激活作用具有浓度依赖性。在此基础上加入20mM EGTA(钙离子螯合剂),该通道概率降低到0.0599±0.0070(n=5, P=0.00040.01), HIR激活BKCaα通道电流的作用仍存在。说明HIR对稳定转染细胞系BKCaα通道电流的激活作用不依赖于钙离子。BKCaα通道电流的幅度值(Amplitude, Amp)随着药物浓度的增加无明显变化；BKCaα通道的平均开放时间(Open Time, To)随着药物浓度的增加有所增加,在200mg/LHIR时,与对照组相比较具有统计学差异；BKCaα通道的平均关闭时间(Close Time, Tc)随着药物浓度的增加有所降低,各组间无统计学差异。结论：1.HIR具有血管舒张。2.HIR的舒血管作用与HIR激活BKca通道相关。3.HEK293细胞上转染BKCaα通道具有BKca通道基本特性。4.HIR对HEK293细胞上转染BKCaα通道激活作用具有浓度依赖性,且不依赖钙离子。
[Abstract]:Objective : To study the effect of high conductance calcium - activated potassium channels ( BK ca ) on vascular smooth muscle cells ( VSMRs ) . ( 2 ) A single - channel patch clamp experiment was carried out : The expression plasmid pcDNA3.1 - BK was transfected with the Lipofectamine 2000 transfection method , and the stable expression of monoclonal cell line was screened by 0.8 mg / ml G418 . ( 4 ) When 0.8渭M NE induced pre - contraction of blood vessels , the different concentrations of HIR were added to observe the relaxation and relaxation of vascular rings . ( 2 ) The effect of HIR on BK Ca 伪 channel current was increased gradually with increasing concentration of HIR . The effect of HIR on the channel current of stable transfected cell line BK Ca 伪 was decreased to 0.0159 卤 0.0014 ( n = 5 , P = 0.0060.05 ) , 0.048 卤 0.0073 ( n = 5 , P = 0.0000.070.05 ) , 0.0856 卤 0.0103 ( n = 5 , P = 0.000290 . 01 ) .

【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R285.5

【参考文献】