雷公藤甲素—核仁素适配子耦合物靶向治疗进展性胰腺癌的体内外选择性及抗肿瘤活性研究

发布时间：2018-02-14 23:27

  本文关键词： 胰腺癌 雷公藤甲素 核仁素适配子 选择性 流式细胞术　出处：《湖北大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：进展性胰腺癌(advanced pancreatic cancer, PC)是一类高转移、易复发、有着极差预后的常见消化道恶性肿瘤。目前临床上并没有明显效果的化疗药物,多药耐药性及癌细胞转移是造成胰腺癌化疗失败的主要原因。雷公藤甲素(triptolide, TP)能在体外通过多种机制显著抑制多药耐药胰腺癌细胞株的生长,显示出了优于吉西他滨的抗肿瘤效果。但雷公藤甲素的非特异性组织分布造成了严重的肝毒性,限制了其向临床转化。核酸适配子(aptamer)是一种能特异性结合到靶细胞表面的单链寡聚核苷酸核,核仁素特异性适配子AS1411具有核仁素(胰腺癌细胞表面高表达)靶向性及较好的安全性；我们以AS1411为“靶头”,以胰腺癌细胞表面高表达的核仁素为药物传递靶点,促使雷公藤甲素特异性靶向并内化入胰腺癌细胞。本研究在体外细胞水平及胰腺癌小鼠模型体内考察了雷公藤甲素-核仁素适配子耦合物的靶向性及抗肿瘤活性,从而为其向临床转化提供了有力证据。 目的：本研究作为智能雷公藤甲素-核酸耦合物靶向抗胰腺癌新药开发的一部分,目的是在体内外考察雷公藤甲素-核仁素适配子耦合物的靶向性及抗肿瘤活性,并对其进入细胞途径和抗肿瘤机制作初步探究,为进一步体内的药理,毒理研究及向临床转化提供参考依据。 方法： 1.体外选择性考察： 人胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2),人正常胰腺细胞株(HPC-Y5),人正常肝细胞株(L-02)分别与Cy3荧光标记的TP-AS1411耦合物,TP-CRO耦合物在37℃下共孵育一段时间,离心去除未与细胞结合的配体后,荧光显微镜观察细胞内部的荧光分布情况,流式细胞仪检测不同药物处理的各个细胞系的平均荧光强度。 2.体内选择性分布考察： 雌性裸小鼠10只,建立Mia PaCa-2荷瘤小鼠模型。成瘤后,所有老鼠被随机分为2组(每组5只)：a.Cy3标记的TP-AS1411生理盐水溶液,b.Cy3标记的TP-CRO生理盐水溶液。分别于4,12,24,48小时用荧光成像系统(Xenogen IVIS imaging system)进行活体荧光检测,并于24小时后处死,收集心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等组织并检测各自荧光强度。 3.体外抗肿瘤活性考察： MTT实验检测不同浓度的TP-AS1411耦合物对人胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2)分别在24小时和48小时的杀伤作用,以TP和吉西他滨为阳性对照。免疫印迹法(Western Blot)检测不同浓度药物处理的细胞中及血管内皮新生因子(VEGF)表达水平的变化情况。 4.胰腺癌小鼠模型治疗效果评价： 雌性裸小鼠建立Mia PaCa-2荷瘤小鼠模型,成瘤后,随机分成5组(每组10只)：a.空白生理盐水溶液(空白对照组),b.雷甲素乙醇／水溶液,c.吉西他滨药物组,d. TP-AS1411耦合物药物低剂量组,e:TP-AS1411耦合物高剂量组。进行治疗试验,以小鼠生存周期、体重、肿瘤生长抑制率为考察指标。每周给药一次,连续给药8周后,结束治疗。麻醉取血后直接处死,血清样本用ELISA检测VEGF表达水平,将实体瘤剥离,称瘤重,并拍照。 结果： 1. TP-AS1411耦合物与Mia PaCa-2细胞结合的荧光强度明显高于其它与其它细胞结合的荧光强度。而对照组药物与三种细胞结合的荧光强度几乎没有区别。 2.对于TP-AS1411耦合物组,肿瘤部位的Cy3荧光信号在整个实验过程中一直都很明显,而在其它正常组织中的荧光信号相对较弱,且在24h后几乎完全消除。对于TP-CRO对照组,Cy3荧光信号的分布没有表现出明显的特异性,且48h时在肝、肾脏等组织中依然能检测到较强的荧光信号。 3.随着三种药物浓度的增加及药物作用时间的延长,Mia PaCa-2细胞的存活率都有不同程度的降低,而且表现出了时间剂量依赖性,相同浓度下TP-AS1411对Mia PaCa-2的生长抑制率总要高于吉西他滨对它的(25nM-200nM)。在50nM,100nM及200nM的浓度梯度内,TP-AS1411耦合物都能有效的抑制Mia PaCa-2细胞系中VEGF的表达。 4.用药第4,8周后,TP-AS1411耦合物高剂量组抑瘤率分别为56.33%和74.29%,TP-AS1411耦合物低剂量组抑瘤率为48.27%和67.24%,吉西他滨对照组抑瘤率分别为40.29%和44.35%。ELISA结果显示,经过TP-AS1411耦合物干预后,荷瘤鼠外周血中VEGF含量得到显著水平的降低,接近正常水平。 结论： 1.TP-AS1411耦合物在体外能选特异性地靶向Mia PaCa-2细胞,而规避其它正常细胞。 2.TP-AS1411耦合物在荷瘤鼠体内能选择性的在肿瘤组织内大量积聚,而相对减少在其它正常组织内的分布。 3.无论是在体内外,AS1411对TP的修饰未影响其抗肿瘤活性及抗肿瘤血管新生活性。
[Abstract]:Background: advanced pancreatic cancer (advanced pancreatic, cancer, PC) is a kind of high metastasis, recurrence, have a poor prognosis of common malignant tumor of digestive tract. Chemotherapy drugs currently in clinical and there is no obvious effect, multidrug resistance and metastasis of cancer cells is the main cause of pancreatic cancer treatment failure. Triptolide (triptolide, TP) through a variety of mechanisms can significantly inhibit the multidrug resistance of pancreatic cancer cell lines in vitro showed superior to gemcitabine antitumor effect of triptolide. But nonspecific tissue distribution caused severe hepatotoxicity, restricts its clinical transformation. Aptamer (aptamer) is a a specific binding to single stranded oligo nucleotide poly nuclear target cell surface nucleolin, specificity of aptamer AS1411 with nucleolin (high surface expression of pancreatic cancer cells) targeting and good safety; we As the "target" with AS1411, with a high surface expression of pancreatic cancer cell transfer targets for drugs in the nucleolus, prompting prime specific target of triptolide in pancreatic cancer cells and to internalize into. In this study, in vitro and in a mouse model of pancreatic cancer effects of triptolide - nucleolin aptamer coupled complex target orientation and antitumor activity, thus provides the powerful evidence to clinical transformation.
Objective: the purpose of this study as intelligent triptolide - nucleic acid conjugates targeting part of anti pancreatic cancer drug development, the purpose is to investigate the effects of triptolide - nucleolin aptamer conjugates targeting antitumor activity to and in vivo, and the way to enter the cell and anti tumor mechanism for a preliminary inquiry, further in vivo pharmacological, toxicological study and clinical transformation to provide reference.
Method锛，

本文编号：1511875