顺铂通过miR-16下调BDNF表达抑制SH-SY5Y细胞生长的研究

发布时间：2018-02-23 00:41

本文关键词： 顺铂 miRNA 神经母细胞瘤脑源性神经营养因子细胞增殖基因表达　出处：《山东大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：神经母细胞瘤是儿童时期最常见的恶性肿瘤,平均发病年龄为17个月。肿瘤起源于神经嵴组织,发生在人体深部肾上腺髓质和椎旁神经节位置。由于没有特定的临床表现,大约50%到60%的患者被确诊时已到晚期。经过多学科治疗,甚至引入剂量密集化疗方案,但高风险神经母细胞瘤的预后仍然无明显改善,5年生存率小于50%。 MicroRNAs(miRNAs)是非编码小RNA,参与基因表达的转录后调控。通过与靶mRNA不完全结合,导致翻译抑制或靶基因的不稳定。miRNA可作为肿瘤抑制基因和癌基因。研究表明,miR-106a在胃癌组织中过表达,具有致瘤作用。miR-16作为肿瘤抑制基因,通过调节BMIl,在套细胞淋巴瘤SP细胞中表达下调,导致裸鼠淋巴瘤移植瘤缩小。脑源性神经营养因子(BDNF),是神经营养因子家族的成员,通过与其特异性受体TrkB结合,在神经元存活、分化、和轴突延伸过程中起着非常关键的作用。研究表明,BDNF-TrkB信号通路不仅能调节神经元的生长,而且还影响许多肿瘤,如肺癌,膀胱癌,胰腺癌等的发生、侵袭和预后。最近的一项研究表明,BDNF能增强移行细胞癌的增殖和存活。BDNF高表达与肿瘤(包括胰腺癌和乳腺癌)恶化有关。顺铂是治疗神经母细胞瘤的有效药物,它可以抑制神经母细胞瘤细胞的生长,然而有关顺铂抗肿瘤作用的分子机制还不明确。在以往的研究中,我们发现miR-21的表达在顺铂治疗后明显下降,而miR-21又可以下调MSH2在细胞内的表达水平,这一结果提示我们探讨顺铂作用后引起的miRNA表达变化,并检测下游分子的改变,能够进一步明确顺铂抗癌机制,也为新型抗癌药物的开发提供科学依据。基于miR-16和BDNF目前公认的作用,以及二者之间可预测的相关性,在本研究中,我们选择miR-16和BDNF作为研究对象,来探讨顺铂抗肿瘤作用的分子机制。为了明确顺铂、miR-16和BDNF在神经母细胞瘤内的表达情况以及三者之间的相关性,本研究设计三部分实验来进行：(一)研究顺铂抑制SH-SY5Y细胞生长及相关分子miR-16、BDNF的表达变化；(二)研究miR-16抑制SH-SY5Y细胞生长的机制；(三)研究顺铂对SH-SY5Y细胞移植瘤的抑制及影响机制。第一部分顺铂抑制SH-SY5Y细胞生长及相关分子miR-16、BDNF表达变化的研究目的：研究顺铂对SH-SY5Y细胞生长的影响,阐明顺铂作用后miR-16和BDNF两种分子在细胞内的表达情况。方法：取生长状态良好的SH-SY5Y细胞接种到细胞培养板,培养过夜后,每孔加入不同剂量的顺铂,使培养基中的顺铂浓度分别为0μg/ml,1.5μg/ml；3μg/ml；4.5μg/ml;6μg/ml;12μg/ml。继续培养48h后,分别进行如下实验：放在倒置相差显微镜下,观察细胞的状态和数量；向培养孔内加入MTT溶液,4h后弃掉培养基,每孔加100μl DMSO溶解结晶,570nm波长测量吸光度值,并计算细胞生长抑制率：使用Annexin V-FITC和PI对收集的细胞进行双染,通过流式细胞仪检测,分析不同浓度下各组的细胞凋亡率；收集顺铂作用后的SH-SY5Y细胞,提取细胞总RNA,并通过实时定量PCR检测细胞内miR-16的表达水平；提取细胞蛋白,进行电泳分离并转印到PVDF膜上,用BDNF抗体进行杂交,再通过酶标的二抗使底物显色,拍照后观察BDNF在细胞内的表达情况。结果：随着顺铂浓度的增加,视野下可见的活细胞密度逐渐减少,而漂浮的死细胞数目增多,细胞密度降低；MTT结果显示,当顺铂浓度达到6μg/ml时,细胞生长抑制率已超过一半,并且抑制率与顺铂的浓度呈正相关；通过流式细胞仪检测,结果显示,0gg/ml组细胞凋亡率明显低于顺铂作用后的各组,并且随着顺铂浓度的升高,细胞凋亡率逐步升高；实时定量PCR结果表明,顺铂作用后,SH-SY5Y细胞内miR-16表达显著升高；Western blotting测定细胞内BDNF的表达,在顺铂浓度达到3μg/ml后,细胞内BDNF的表达水平显著降低。结论：顺铂可以抑制SH-SY5Y细胞的生长,引起细胞凋亡增加；同时,顺铂还可以使细胞内miR-16表达升高；相反的,在顺铂作用后细胞内BDNF的表达降低。第二部分miR-16抑制(?)H-SY5Y细胞生长机制的研究目的：明确miR-16对SH-SY5Y细胞生长的影响,预测miR-16与BDNF的相关性,并证明miR-16对BDNF表达的影响。方法：化学合成miR-16的双链寡核苷酸链,当培养板内的SH-SY5Y细胞密度达到60%左右时,通过脂质体法将miR-16或阴性对照的寡核苷酸转染到细胞内,更换培养基继续培养48h后,进行后续实验：在倒置相差显微镜下,观察细胞的状态和数量；通过MTT法测定各组细胞的吸光度值,并通过公式计算细胞生长抑制率；Annexin V-FITC和PI双染后,通过流式细胞仪检测miR-16诱导的细胞凋亡率；通过生物信息学分析,预测miR-16与BDNF的相关性；通过Western blotting技术检测miR-16转染SH-SY5Y细胞后BDNF的表达水平。结果： SH-SY5Y细胞在转染miR-16后,细胞数量较正常对照和转染NC组明显减少,细胞密度降低,同时细胞形态也发生变化,贴壁程度有所减轻；MTT检测细胞增殖抑制率,结果表明,较正常对照组和NC组,miR-16转染组细胞增殖抑制率明显升高(见图7),经统计学t检验分析,差异具有统计学意义(p0.01)。Annexin V-FITC/PI双染后,转染miR-16的实验组细胞凋亡率达到33.7%,与对照组相比明显升高；为了证实miR-16与BDNF之间的相关性,我们通过生物信息学分析的方法,发现在BDNF-3'-UTR存在miR-16的匹配位点；进一步通过Western blotting检测,结果显示,BDNF在miR-16作用后表达量明显降低。结论： miR-16可以发挥抑癌基因的功能,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡；BDNF-3'-UTR区域存在miR-16的匹配位点；miR-16可以下调癌基因BDNF的表达而发挥作用。第三部分顺铂对SH-SY5Y细胞移植瘤的抑制及机制研究目的：在个体水平,探讨顺铂对裸鼠移植瘤生长的影响；进一步证明顺铂可以影响移植瘤细胞中miR-16和BDNF的表达,在个体水平证明顺铂可以升高miR-16的表达,而后者可进一步下调BDNF的表达。方法：大量培养SH-SY5Y细胞,准备注射到裸鼠背部皮下造模；通过腹腔注射戊巴比妥钠使裸鼠麻醉后,每个点注射1×107个SH-SY5Y细胞；当肿瘤体积增大到大约100mm3时,对实验组动物腹腔注射顺铂进行干预,顺铂用量为3mg/kg,对照组腹腔注射等体积的生理盐水；顺铂每四天注射1次,共治疗4次；最后一次注射结束后的第四天,将裸鼠处死,然后将瘤体从背部皮下取出；将同组处理的瘤体放在一起观察,拍照；用电子天平称量每个瘤体的重量,记录并计算均值；提取细胞RNA,通过实时定量PCR检测瘤体细胞内miR-16的表达水平；提取瘤体内总蛋白后,进行电泳、转印、抗体杂交等步骤,最后放入化学发光成像仪,拍照观察蛋白条带,分析BDNF在裸鼠移植瘤内的表达情况。结果：注射SH-SY5Y细胞至裸鼠背部皮下后,每天观察成瘤情况,并测量估算瘤体大小；约5-7天后,瘤体体积达到大约100mm3,开始使用顺铂对实验组裸鼠进行干预；治疗完毕,取出细胞移植瘤,可见顺铂处理组肿瘤体积明显减小,顺铂在裸鼠体内可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖；使用精密电子天平称量瘤体的重量,注射生理盐水组的瘤重为0.135±0.015g,而顺铂干预后瘤重为0.057±0.018g；实时定量PCR检测瘤体内miR-16的表达,结果显示与对照组相比,在顺铂干预后,瘤体内miR-16表达显著升高,这一结果与细胞水平的实验结果是一致的；Western blotting检钡SH-SY5Y细胞移植瘤体内BDNF的表达,发现在顺铂干预后,瘤体细胞内BDNF的表达水平显著减低。结论：顺铂可以抑制裸鼠SH-SY5Y细胞移植瘤的生长；顺铂可以增加瘤体细胞内miR-16的表达水平,相反,瘤体内BDNF的表达水平降低。三部分整体结论：顺铂可以抑制SH-SY5Y细胞的生长增殖,促进细胞的凋亡,也可以抑制SH-SY5Y细胞裸鼠移植瘤的生长；顺铂可以通过升高miR-16的表达发挥作用,而miR-16可以抑制细胞和裸鼠移植瘤体内BDNF的表达；在细胞和个体水平,顺铂都能通过上调miR-16表达,进而下调BDNF表达,来发挥抑制细胞生长的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4

【参考文献】