缺血预处理和远端缺血期处理对肝移植缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2018-02-23 11:44

本文关键词： 小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤缺血预处理远端缺血期处理　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分小鼠原位肝移植模型的建立和评价目的:建立成熟稳定的非动脉化的小鼠原位肝移植模型,并对肝移植模型进行评价,为后续相关实验奠定基础,亦为欲建立小鼠原位肝移植模型的研究者提供经验支持和技术参考,以快速、平稳、安全地渡过学习瓶颈期。方法:单人操作,采用双袖套法和支架法行非动脉化的小鼠同种异体原位肝移植术,详细记录供受体手术时间、无肝期、肝上下腔静脉吻合时间、存活时间等指标,并探查死亡原因。手术方法定型后选用80对B6小鼠进行模型评价,前6组(每组10例)分别于术后第1天、3天、5天、7天、1个月、2个月行组织病理学检查和肝功检测,第7组(共20例)进行远期存活率监测。结果:建立模型过程中共行小鼠原位肝移植手术1074例,其中前541例主要用于锻炼操作技能和积累围手术期管理经验,之后453例主要为熟练定型阶段。学习曲线表现为随着练习次数的增加,供受体手术时间、无肝期、肝上下腔静脉吻合时间均呈递减趋势,手术成功率和存活时间亦相应得到改善,但整体变化非常平缓。建模初期小鼠死亡原因多为无肝期过长、供体灌注不良、肝上下腔静脉和肝下下腔静脉吻合口出血,后期死亡原因主要为胆道并发症。模型评价阶段,无肝期为17.4±2.3min,SHVC吻合时间为11.0±1.3min,手术成功率为96.3%(77/80),术后第1天、第3天、第5天、第7天、1个月、2个月和3个月的存活率分别为95%(19/20),95%(19/20),90%(18/20),85%(17/20),75%(15/20),60%(12/20)和35%(7/20)。ALT和AST在术后第三天达到峰值,肝脏病理学改变最为明显。结论:在大量的练习和不断的摸索、尝试后成功建立了小鼠原位肝移植模型,熟练的显微外科操作技术是首要条件,手术的难度在于操作的复杂性和手术步骤的严格时限,手术的关键在于麻醉、供肝的灌注和保存、套管技术和无肝期的精准把控。术后肝脏组织病理学和肝功变化规律为下一步研究缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠原位肝移植后缺血再灌注损伤的保护作用提供了实验依据。第二部分缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用及其机制目的:观察远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤是否具有保护作用,比较缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤保护作用的强度,并探究二者联合应用是否能产生叠加的保护作用及可能存在的作用机制。方法:160只健康成年雄性B6小鼠随机分成4组:假处理组(sham组,n=40):仅行小鼠原位肝移植术,无任何特殊处理;2缺血预处理组(IPC组,n=40):供体开腹后游离肝脏,用显微血管夹夹闭小鼠肝动脉和门静脉10分钟,开放15分钟后,进行供肝的获取;3远端缺血期处理组(RIPer组,n=40):受体麻醉后,在肝脏再灌注前用显微血管夹对小鼠两侧股血管束反复进行5分钟夹闭、5分钟开放,共3个循环;4联合应用缺血预处理和远端缺血期处理组(IPC+RIPer组,n=40):供体行缺血预处理,受体行远端缺血期处理。各组小鼠分别于再灌注后2小时、24小时和72小时切取肝脏行组织病理学检查、TUNEL染色、F4/80免疫组化染色、MDA水平检测、GSH-Px水平检测、ICAM-1 m RNA、Bcl-2 m RNA及Bax m RNA水平检测、NF-κB p65蛋白表达水平检测,并从下腔静脉取血检测血清ALT、AST、TNF-α、NOx水平,流式分析外周血白细胞表面抗原CD11b、CD16/32和F4/80的表达情况。结果:虽然各组间小鼠术后存活率无统计学差异,但是与sham组相比,三个处理组小鼠术后的ALT、AST、MDA、TNF-α、ICAM-1 m RNA、NF-κB p65蛋白水平、Suzuki评分、凋亡指数、肝脏组织中F4/80阳性细胞比例、CD11b+和F4/80+细胞在白细胞中的比例、CD11b+CD16/32+细胞和CD11b+CD16/32high细胞在CD11b+细胞中的比例上升幅度均较小,而GSH-Px、NOx以及Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值则有所提升(P0.05)。在移植术后早期(2h),IPC组和RIPer组在ALT、TNF-α、GSH-Px、NOx和肝脏组织F4/80阳性细胞比例等方面有统计学差异。除Suzuki评分、Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值、F4/80+细胞在白细胞中的比例外,其他指标均在不同的时间点显示IPC组和RIPer组均与IPC+RIPer组有显著性差异(P0.05)。结论:本实验采用的远端缺血期处理策略可以对小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤发挥有效的保护作用。在移植术后早期(2h),远端缺血期处理对小鼠原位肝移植IRI的保护作用弱于IPC,然而后期两者的保护效力无明显区别。提示远端缺血期处理同缺血预处理一样,亦有两个保护时间窗,而在第一保护时间窗内抑制库弗细胞活化、调整微循环障碍及抗氧化作用较弱导致其保护效力较弱。联合应用缺血预处理和远端缺血期处理可以在抗氧化应激、抗凋亡、调整微循环障碍、抑制固有免疫反应方面产生叠加作用,从而进一步加强对小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3

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