抑制高迁移率族蛋白1对BXSB小鼠的影响

发布时间：2018-03-01 22:29

本文关键词： 系统性红斑狼疮狼疮肾炎高迁移率族蛋白1 BXSB鼠 Caspase-1　出处：《山东大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：高迁移率族蛋白1(High-mobility group box1,HMGB1)作为一种高度保守的蛋白质先前被认为是一种DNA结合蛋白,参与维护核小体结构和基因转录的调控。首次发现时被认为是一种染色体蛋白质,后来认为在神经元细胞以膜结合形式存在,被称为“二性霉素B”。细胞内的HMGB1可以由活化的细胞主动分泌、或凋亡细胞等被动释放至细胞外。最近研究已经证实细胞外的HMGB1是一种有效的促炎细胞因子,能刺激血管内皮细胞、单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子和黏附分子,招募炎症细胞至损伤部位,参与许多炎性疾病,如肠道炎性疾病、肿瘤和风湿性疾病。同时HMGB1还是树突状细胞成熟和Thl细胞极化过程中的一个调节因子, HMGB1在细胞外可诱导TNF-a、IL-1、IL-6及多种粘附分子如VCAM-1和MCP-1的表达,同时HMGB1对于维持Th1/Th2细胞因子之间的平衡也有着重要作用。除了直接的致炎和刺激免疫的作用,HMGB1还可以作为一种内源性的免疫佐剂,通过诱导自身免疫反应和干扰凋亡细胞的清除来促进疾病的发生发展。以往的研究已经证实,HMGB1和多种自身免疫性疾病相关,并已成为类风湿关节炎的治疗靶点。系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种典型的系统性自身免疫性疾病,以一种多因素参与、多种自身抗体产生和免疫复合物沉积、多个脏器受累为疾病特点。SLE的自身抗体是以针对细胞核成分为主的,并且这些自身抗体的存在于许多临床表现相关,其中狼疮肾炎(Lupus nephritis,LN)是SLE最严重的并发症之一,与病情发展和死亡率密切有关。虽然在过去的几十年里药物治疗效果有显著提高,但是,发展为终末期肾病的高风险,加上药物的副作用大,促使我们寻找更有效并且毒副作用更小的药物来治疗LN。SLE和LN的发病机制及药物治疗长期以来就是风湿免疫研究领域的难点。因此研究SLE和LN的发病机制、寻找有效的治疗措施,对于改善患者生存质量,具有十分重要的意义。免疫调节异常在SLE的发病过程中起着主导作用,其中包括免疫细胞功能异常、多种细胞因子表达异常。另外,SLE典型的血清学特征是大量自身抗体的产生,尤其是针对各种自身组织成分的抗体,包括抗核小体抗体和抗DNA抗体。有人提出,凋亡细胞是自身抗原的来源。SLE患者由于清除机制缺陷,导致凋亡细胞不断积累成为晚期凋亡细胞甚至二级坏死细胞。研究表明,HMGB1与核小体从凋亡细胞释放有关,并且HMGB1可以提高核小体的免疫刺激作用。此外,研究发现,SLE患者的血清中核小体以及HMGB1水平显著升高,HMGB1被认为是组成DNA免疫复合物的成分之一。然而,HMGB1在SLE的病理生理学的作用方式尚不清楚。SLE患者血清中升高的DNA免疫复合物浓度等数据证明,HMGB1与RAGE通过激活浆细胞样树突状细胞和B细胞产生针对DNA的抗体从而导致自身免疫的发生。此外,HMGB1能够激活B细胞。已经在SLE患者血清中检测到]HIMGB1和抗HMGB1抗体水平升高,因此HMGB1被认定是一种新的自身抗原。有关HMGB1与SLE的发病关系国外虽已有少量研究报道,但研究结果不尽相同。HMGB1在SLE中的作用机制尚不清楚,抑制HMGB1是否可以对SLE疾病产生影响?HMGB1是否可以作为SLE治疗的一个潜在靶点? 目的：利用BXSB狼疮小鼠模型,应用HMGB1单克隆抗体(HMGB1mAb)抑制HMGB1的作用,通过抑制HMGB1对BXSB狼疮小鼠模型疾病表现的影响,探讨HMGB1在SLE发病机制中的作用、HMGB1可能作为治疗SLE的治疗选择及其基本的作用机制,为SLE的治疗提供新的治疗策略和实验依据。方法：以24只16周龄雄性BXSB狼疮小鼠为研究对象,随机分为2组,HMGB1mAb实验组和IgG对照组,每组12只。HMGB1mAb实验组小鼠用中和性抗HMGB1单克隆抗体(HMGB1mAb)进行处理,从16周龄到26周龄(共10周)每周三次腹腔内注射抗HMGB1抗体(10μ g/鼠)。IgG对照组BXSB狼疮小鼠从16周龄到26周龄每周三次给予腹腔内注射相同剂量的Ig(10μg/鼠)。于实验起点0周、2、4、6、8、10周末分别收集各组小鼠24小时尿液。离心去沉渣,-20℃保存待检。尿蛋白浓度用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测,尿肌酐浓度检测用Beckman全自动生化仪检测,计算尿蛋白/肌酐比率。实验终点处死小鼠后取出脾脏标本以电子称称重,利用脾脏指数(SI)衡量脾肿大,(SI=(脾脏重量/体重)×1000)。实验结束时,乙醚麻醉小鼠,断头取血,离心分离血清,采用ELISA法测定血清抗dsDNA抗体和循环IgG水平,三重测定0D490的方法来记录血清值,抗ds-DNA抗体和循环IgG水平记录单位为U/ml,阳性对照标准值来自于混合的发病BXSB小鼠血清。取小鼠肾脏标本,切取一侧肾皮质置于10%福尔马林缓冲溶液固定2小时后脱水,石蜡包埋,组织切片经苏木素-伊红(HE)染色后进行肾脏组织病理学观察,用ImageJ(ImageJ NIH)进行图像分析。我们通过检查20个肾小球横截面(GCS)来评估肾小球病理变化,进行组织学评分；切取另一侧肾皮质,迅速置于液氮中快速冰冻,用荧光素标记抗鼠IgG和抗鼠C3染色,荧光显微照片评价免疫荧光的强度和范围。采用流式细胞微球阵列(CBA)技术,利用Mouse Inflammation Cytometric Bead Array试剂盒和FACSCalibur流式细胞分析仪测定BXSB狼疮小鼠外周血血清中炎性细胞因子IL-1β、 IL-6、 IL-17、IL-18和IFNα水平。提取小鼠肾脏组织蛋白,用Bradford蛋白质测定法测定蛋白浓度,采用分光光度法检测组织裂解液中Caspase-1活性。0D405值升高表示Caspase-1活性增加。采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。计量数据用平均值±标准差(SD)表示。组间比较采用了未配对的双尾Student t检验或Kruskal-Wallis检验。p0.01表示有统计学意义。结果： 1.HMGB1mAb可以减轻BXSB狼疮小鼠的尿蛋白水平、尿蛋白/肌酐比率和脾脏肿大。两组小鼠从16周龄开始出现蛋白尿。HMGB1mAb治疗组的小鼠从治疗8周后蛋白尿较IgG对照组下降,并且HMGB1mAb治疗组的尿蛋白/肌酐比率较IgG对照组小鼠下降(p0.01)。通过脾重指数SI显示,HMGB1mAb治疗组的BXSB小鼠的脾脏肿大较IgG对照组明显减轻(p0.01)。 2.HMGB1mAb可以降低BXSB狼疮小鼠血清抗dsDNA抗体和循环IgG水平。IgG对照组小鼠在26周龄时血清抗dsDNA抗体水平显著升高,而在HMGB1mAb治疗组这一升高被明显抑制(p0.01)。HMGB1mAb治疗组在26周龄时与工gG对照组相比,血清循环IgG水平显著降低(p0.01)。 3. HMGB1mAb可以减轻BXSB狼疮小鼠肾脏病理学表现和免疫复合物沉积。对HE染色肾组织学评分来评估肾小球炎症程度,IgG对照组BXSB狼疮鼠表现出狼疮样弥漫性肾小球肾炎,而HMGB1mAb治疗组小鼠肾脏表现为肾小球病理组织学显著改善(p0.01)。HMGB1mAb治疗组BXSB狼疮鼠较IgG对照组相比,肾小球IgG和补体C3沉积显著减少(p0.01)。 4.HMGB1mAb降低了BXSB狼疮小鼠外周血血清炎症细胞因子水平。在实验结束时留取HMGB1mAb治疗组和对照组BXSB狼疮鼠的外周血清。HMGB1mAb治疗组小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18和IFNα水平较IgG对照组均显著降低(p0.01)。 5. HMGB1mAb降低了BXSB狼疮小鼠肾脏Caspase-1活性。HMGB1mAb治疗组小鼠肾脏Caspase-1活性显著降低,与IgG对照组相比具有统计学意义(p0.01)。结论： HMGB1mAb可以明显改善BXSB小鼠的临床和组织学表现,表现为尿蛋白／肌酐比率下降、脾肿大减轻、血清抗ds-DNA抗体水平和循环免疫复合物水平下调、肾脏病理学改变及免疫沉积方面均有明显改善。HMGB1mAb对BXSB小鼠发挥保护作用的机制可能有：抑制自身免疫和炎症反应体系,减少炎性细胞因子的产生并抑伟Caspase-1活性；抑制抗dsDNA抗体和循环免疫复合物形成,在免疫复合物的存在中起功能性作用。在SLE中,HMGB1是一个潜在的治疗靶点,抑制]HMGB1可以延缓狼疮病情发展。本研究为临床上以HMGB1为靶点而治疗SLE和LN提供了实验依据和新思路。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R593.241

【共引文献】