普伐他汀对腹主动脉瘤形成的影响和机制研究

发布时间：2018-03-04 16:23

本文选题：腹主动脉瘤　切入点：普伐他汀　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：1研究背景腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种常见的具有潜在致死危险的慢性血管退行性疾病,一旦破裂,死亡率超过85%。在美国,AAA在65岁以上的男性老年人群中发病率达到6%-9%,而每年因AAA破裂导致死亡的人数占总死亡人数的0.8%。目前由于对AAA缺乏有效的内科治疗手段,临床上一旦发现AAA,即采用危险性很高的手术治疗切除AAA,以预防瘤体的破裂而致命。由于AAA具备危害性大、内科治疗效果差及外科手术风险高等临床特征,因此从AAA的发病机制着手,找到致AAA的危险因素,进而预防AAA的形成和破裂,具有重要意义。机制上,AAA是由于动脉中层弹力蛋白破坏、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡、代偿性胶原蛋白沉积等而引起腹主动脉管壁的永久性扩张。血管壁的炎症反应和基质降解是引起AAA的关键因素。例如,在动物实验研究中,血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)能上调氧化应激,从而启动基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的基因转录,最终导致AAA形成。他汀类药物(3-羟基-3-甲基戊二酰单酰辅酶A还原酶抑制剂)除了具有强效降脂作用外,还能通过抑制VSMC增殖、阻止内皮细胞黏附、改善内皮功能以阻止动脉粥样硬化的形成。他汀类药物也可引起不良作用,例如胰岛素抵抗、肝酶升高、骨骼肌毒性和心肌萎缩。然而,现有的研究结果中他汀类药物对AAA的作用尚存在分歧。例如,普伐他汀在低剂量(5mg/kg/day)时可以抑制脑动脉瘤的形成,而在高剂量(25mg/kg/day和50mg/kg/day)时则促进雌激素敲除大鼠脑动脉瘤的形成。与之不同的是,辛伐他汀抑制了 AngⅡ所诱导的载脂蛋白E基因敲除(Apoe-/-)小鼠AAA的形成;瑞舒伐他汀和阿托伐他汀对AAA无影响。AMP 活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在真核生物能量稳态中起重要作用,它含有α、β、γ三种亚单位,其中αα是催化亚单位,β和γ是调节亚单位。前期研究发现吸烟的主要活性成分尼古丁可激活AMPK,最终导致了 Apoe-/-小鼠AAA形成;普伐他汀在骨骼肌细胞和内皮细胞能激活AMPK,提示普伐他汀可能促进AAA形成。激活蛋白2α(Activator protein 2α,AP-2α)是AP-2转录因子家族成员之一。研究发现敲除AP-2转录因子的小鼠由于异常发育在出生之后就会死亡,提示AP-2转录因子对哺乳动物是必不可少的。Park等人研究认为神经生长因子能活化转录因子AP-2α依赖的MMP-2的基因转录,引起内皮细胞侵润,最终促进血管形成。前期研究发现AMPKα2作为AP-2α转录因子的上游激酶,能磷酸化转录因子AP-2α的第219个丝氨酸残基(AP-2α protein at serine 219,AP-2α-S219);阿司匹林可激活AMPK,从而增加了 AP-2α转录因子的表达,最终发挥稳定易损性动脉粥样斑块的作用。综上所述,现有的研究结果中他汀类药物对AAA的作用仍然存在分歧,且有关普伐他汀在AngⅡ所诱导的Apoe-/-小鼠AAA中的作用尚无研究报道。因此,应用AngⅡ诱导的Apoe-/-小鼠的AAA模型,探讨普伐他汀对AAA的影响及机制研究。2目的(1)观察普伐他汀在持续灌注Ang Ⅱ所诱导的Apoe-/-小鼠AAA形成中的作用;(2)探讨普伐他汀促进AAA形成的分子机制。3方法3.1构建AMPK或者AP-2 α慢病毒载体根据三个不同序列的AMPK shRNA或者AP-2α shRNA,转染小鼠VSMCs验证AMPK或者转录因子AP-2α干扰效果,筛选干扰效果最优的shRNA序列构建慢病毒载体。3.2动物模型的建立体内动物实验分为四部分。第一部分:观察普伐他汀对Ang Ⅱ所诱导的Apoe--/-小鼠AAA的影响。选取8-12周龄(体重20-25克)雄性Apoe-/-小鼠91只,先用普伐他汀(50mg/kg/day)喂养小鼠4周,然后将生理盐水或者AngⅡ(0.72mg/kg/day或者1.44mg/kg/day)装入植入式胶囊渗透压泵中,将渗透压泵埋于小鼠皮下持续恒速泵入28天,并持续给予普伐他汀。全程给予普通饮食喂养。8周后实验结束,小鼠予以安乐死。第二部分和第三部分:应用干扰AMPK或者AP-2α的慢病毒探讨普伐他汀对AngⅡ诱导的AAA的作用是否由AMPK或者AP-2α介导。选取8-12周龄(体重20-25克)雄性Apoe-/-小鼠90只,给予普伐他汀(50mg/kg/day)喂养小鼠4周后尾静脉注射慢病毒,慢病毒注射后第二天,将AngⅡ(1.44mg/kg/day)装入植入式胶囊渗透压泵中,然后将渗透压泵埋于小鼠皮下持续恒速泵入28天,并持续给予普伐他汀。全程给予普通饮食喂养。8周后实验结束,小鼠予以安乐死。第四部分:观察辛伐他汀和甲羟戊酸对Ang Ⅱ所诱导的Apoe--小鼠AAA的影响。选取8-12周龄(体重20-25克)雄性Apoe-/-小鼠77只,先用普伐他汀(50mg/kg/day,口服)、辛伐他汀(50mg/kg/day,灌胃)和甲羟戊酸(2mg/kg/day,腹腔注射)治疗小鼠4周,然后将AngⅡ(1.44mg/kg/day)装入植入式胶囊渗透压泵中,将渗透压泵埋于小鼠皮下持续恒速泵入28天,并持续给予普伐他汀、辛伐他汀和甲羟戊酸。全程给予普通饮食喂养。8周后实验结束,小鼠予以安乐死。3.3组织病理学检测实验结束后,小鼠予以安乐死,留取胸主和腹主动脉组织,根据AAA定义(腹主动脉最大直径超过正常腹主动脉直径的50%)观察AAA的形成率,并测量腹主动脉的最大直径。制备腹主动脉石蜡切片,厚度为4.5 μm,进行HE染色和Verhoeff弹力纤维染色;免疫组织化学方法检测腹主动脉组织中α-SM actin、MMP-2、MMP-9、4-HNE和P47的含量;免疫荧光方法用于检测腹主动脉组织中GFP、AMPK和AP-2α的表达。3.4细胞培养用4-8代小鼠和人VSMCs进行实验。(1)小鼠VSMCs应用不同浓度(0、0.1、1、10、50、100μM)普伐他汀刺激细胞2h。(2)小鼠VSMCs用10 μM tempol预处理30min后,再用50 μM普伐他汀共孵育2h。(3)小鼠VSMCs用20 μM compound C预处理30min后,再用50 μM普伐他汀共孵育2h。(4)小鼠 VSMCs 转染 Control shRNA 和 AMPK shRNA 或者 AP-2α shRNA干扰AMPK或者AP-2α的表达后,再用50 μM普伐他汀刺激细胞24h。(5)小鼠和人VSMCs用50μM普伐他汀预处理30min后,再用1 mMAngⅡ共孵育24h。(6)小鼠和人VSMCs用50 μM普伐他汀、10 μM辛伐他汀和100 μM甲羟戊酸预处理30min后,再用1 mM AngⅡ共孵育24h。3.5 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的测定利用荧光探针二羟乙锭测定小鼠VSMCs中ROS的水平。3.6 免疫印迹(western blot)利用western blot检测小鼠腹主动脉和VSMCs内pAMPK、AMPK、pAP-2α、AP-2α、MMP-2、MMP-9、NOX4、4-HNE和 P47 的蛋白表达。3.7 RT-PCR从小鼠腹主动脉组织或者干预后的小鼠VSMCs中提取RNA,测定MMP-2和MMP-9的mRNA表达。β-actin用作为内参对照。3.8明胶酶谱法利用MMP明胶酶谱试剂盒检测小鼠动脉和细胞培养基中MMP-2的活性。3.9酶联免疫吸附测定(ELISA)利用ELISA测定人血清中MMP-2的水平。3.10临床标本的收集收集手术后病人的AAA组织用于病理学检测。收集服用普伐他汀后病人的血液,并从血液用提取单核细胞,提取蛋白,利用western blot检测pAMPK、AMPK、pAP-2α和AP-2α的表达。4结果4.1 Apoe-/-小鼠血压变化与对照组相比,AngⅡ输注后的Apoe-/-小鼠的血压均显著升高,然而普伐他汀,甲羟戊酸以及辛伐他汀对小鼠血压无明显影响。4.2 Apoe-/-小鼠血脂的检测普伐他汀及辛伐他汀治疗显著增加Apoe-/-小鼠内TC和LDL-C的水平。4.3普伐他汀增加了 AAA的发生率、死亡率和严重程度对照组小鼠未形成AAA及未发现死亡。AngⅡ(0.72)模型组、AngⅡ(0.72)普伐他汀组、AngⅡ(1.44)模型组和AngⅡ(1.44)普伐他汀组AAA的发生率为 26.67%、53.33%、60.87%和 91.30%,小鼠死亡率为 0.00%、13.33%、21.74%和47.82%。两种剂量的AngⅡ均显著增加了 AAA的发生率和小鼠的死亡率以及小鼠腹主动脉的最大直径和弹力纤维的将解度,然而持续灌注剂量为1.44 mg/kg/day的AngⅡ所诱导的AAA的发生率和小鼠的死亡率以及小鼠腹主动脉最大直径和弹力纤维的降解度比剂量为0.72 mg/kg/day的AngⅡ更加明显,与模型组相比,普伐他汀显著增加了小鼠AAA的发生率、死亡率、严重程度以及腹主动脉最大直径和弹力纤维的降解度。4.4 HE和Verhoff弹力纤维染色模型组AAA可见动脉管壁结构破坏,主要表现在部分弹力纤维断裂、中断,外膜增厚,动脉管壁变薄,呈瘤样扩张,常伴有血栓形成,普伐他汀治疗明显加重了 AngⅡ诱导的AAA动脉管壁组织学的病理变化。4.5普伐他汀在小鼠VSMCs中通过ROS磷酸化ANPK普伐他汀在小鼠VSMCs中呈浓度依赖性的磷酸化AMPK的第172个苏氨酸(pAMPK-T172),Tempol可消除普伐他汀上调Nox4、p47、4-HNE和pAMPK-T172的表达作用。同样的,DHE荧光染色表示,Tempol消除了普伐他汀产生的ROS含量。4.6普伐他汀在小鼠VSMCs中通过ROS磷酸化AP-2 α普伐他汀在小鼠VSMCs中呈浓度依赖性的磷酸化AP-2α第219个丝氨酸(pAP-2α-S219),Tempol可消除普伐他汀上调pAP-2α-S219的表达作用。4.7普伐他汀依赖AMPK磷酸化AP-2 αCompound C可消除普伐他汀上调的pAP-2α-S219的表达水平。然后应用AMPK siRNA转染细胞干扰AMPK的表达进一步观察AMPK在普伐他汀磷酸化AP-2α中的作用,发现AMPK siRNA而不是对照siRNA阻止了普伐他汀对AP-2α磷酸化的影响。4.8普伐他汀在小鼠VSMCs中通过磷酸化AMPK和AP-2 α上调MMP2的基因转录普伐他汀在小鼠VSMCs中呈浓度依赖性的增加MMP-2的蛋白表达,Tempol或者Compound C消除了普伐他汀上调的MMP-2的蛋白和mRNA表达水平以及活性。同样的,用AMPKshRNA干扰细胞AMPK后,MMP-2的蛋白和mRNA表达水平以及活性显著降低。然后用AP-2α siRNA转染细胞干扰AP-2α的表达后进一步观察AP-2α在普伐他汀上调MMP-2表达中的作用。首先,结果发现干扰AP-2α后对普伐他汀磷酸化AMPK无影响,说明AP-2α是AMPK的下游分子。其次,与对照shRNA+普伐他汀组相比,AP-2α shRNA+普伐他汀组的MMP-2的蛋白和mRNA表达水平以及活性显著降低。4.9小鼠VSMCs在AngⅡ刺激状态下,普伐他汀能激活AMPK α 2/AP-2 α/MMP2信号通路。与对照组相比,单独AngⅡ或者普伐他汀刺激细胞均能显著增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表达水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表达水平;而AngⅡ和普伐他汀共孵育进一步的增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表达水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表达水平。4.10人VSMCs在AngⅡ刺激状态下,普伐他汀能激活AMPK α 2/AP-2 α/MMP2信号通路。为观察小鼠效应的平移适用性,即检验这些效应是否表现在人VSMCs上,应用AngⅡ和普伐他汀刺激人VSMCs。结果发现普伐他汀同样能激活静息或者AngⅡ刺激状态下人VSMCs中的pAMPK和pAP-2α的蛋白表达水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表达水平。4.11慢病毒敲除AMPK α后可消除普伐他汀促进Apoe/小鼠AAA形成的作用与注射对照shRNA慢病毒相比,尾静脉注射AMPKα shRNA慢病毒明显抑制了小鼠腹主动脉组织中的AMPKα2蛋白表达。同样的,与对照shRNA组相比,普伐他汀显著增加了AngⅡ诱导小鼠AAA的发生率和死亡率、腹主动脉的最大直径以及AAA组织内弹力纤维的降解,然而尾静脉注射AMPKα shRNA慢病毒组明显消除了普伐他汀促进AngⅡ诱导小鼠AAA形成的作用。4.12慢病毒敲除AP-2α后可消除普伐他汀对AngⅡ诱导的Apoe/小鼠AAA形成的作用与注射对照shRNA慢病毒相比,尾静脉注射AP-2α shRNA慢病毒明显抑制了小鼠腹主动脉组织中的AP-2α蛋白表达。与对照shRNA组相比,普伐他汀显著增加了 AngⅡ诱导小鼠AAA的形成,然而敲除AP-2α后,普伐他汀未表现出促进AAA形成的作用。4.13辛伐他汀不能模仿普伐他汀激活VSMCs内AMPKα2/AP-2α/MMP2信号通路,而且甲羟戊酸不能消除普伐他汀的这一作用不同于普伐他汀,辛伐他汀并不能增加AngⅡ刺激状态下VSMCs中pAMPK、pAP-2α和MMP2的表达水平。而且甲羟戊酸也不能消除普伐他汀上调pAMPK、pAP-2α和MMP2表达的作用。4.14辛伐他汀不能促进AngⅡ诱导的Apoe-/-小鼠AAA的形成与普伐他汀相比,辛伐他汀并没有影响AngⅡ诱导的Apoe-/-小鼠AAA的发生率和死亡率以及腹主动脉最大直径、动脉组织内弹力纤维的降解和MMP-2的表达。4.15甲羟戊酸不能逆转普伐他汀促AAA形成作用单独甲羟戊酸治疗小鼠对AngⅡ诱导的Apoe--小鼠AAA的形成不产生任何影响,而且甲羟戊酸也并不抑制普伐他汀对AAA的影响。4.16 AAA患者腹主动脉组织中的pAMPK和pAP-2 α的水平增高与正常组织相比,AAA组织中pAMPK和pAP-2α的水平明显增高。4.17服用普伐他汀患者外周血细胞中的pAMPK和pAP-2 α的水平增高。与对照患者相比,服用普伐他汀患者外周血细胞中pAMPK和pAP-2α的水平明显增高。此外,ELISA结果显示,普伐他汀服用患者血清中的MMP-2水平也显著增高。5结论(1)普伐他汀促进AngⅡ诱导Apoe-/-鼠AAA的发生率、死亡率和严重性;(2)普伐他汀通过ROS激活AMPK,使AMPKα2进入细胞核内与AP-2α结合后直接磷酸化AP-2α,继而与MMP-2的基因启动子形成复合物,从而活化了MMP-2的基因转录;(3)普伐他汀促进AAA形成的病理机制是通过激活AMPKα2/AP-2α/MMP2信号通路,而不是依赖于HMG-CoA还原酶抑制途径而发挥作用的。1研究背景阿霉素(adriamycin,ADR)是一种临床常用的蒽环类化疗药物,对实体瘤及血液系统肿瘤均有较好的疗效。然而,该药可引发心脏的毒副作用,当ADR在体内累积到一定剂量时会对心脏产生不可逆的损害,导致继发性扩张型心肌病和充血性心力衰竭。目前,阿霉素心肌病(adriamycin-induced cardiomyopathy,ACM)的发病机制仍未完全阐明,其可能的机制包括：氧化应激、心肌细胞凋亡、炎症反应、心肌纤维化、能量代谢异常、钙超载、DNA损伤以及线粒体损伤等,其中心肌细胞凋亡和氧化应激发挥着重要的作用。目前用于减轻ADR诱导的心脏损害的药物有血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)、血管紧张素拮抗剂(angiotensin receptor antagonists,ARB)、抗氧化剂、右雷佐生等,然而不幸的是,这些药物还没有获得足够有效的证据证明其在临床上能常规使用。因此,寻找针对ACM安全而且有效的防护药物,促进ADR的安全应用具有十分重要的临床意义。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在ACM的病理生理过程中发挥着重要作用,而抑制ACE/血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)/1型血管紧张素受体(Type 1 angiotensin receptor,AT1R)轴能够改善ACM的预后。传统上,ACEI和ARB主要参与抑制AngⅡ的合成和阻止AT1R的活化;然而,AngⅡ的降解也在调控AngⅡ水平中发挥着重要的作用,特别在组织水平上。由于ACE2能使AngⅡ失活而限制其血管收缩作用以及能催化AngⅡ形成Ang(1-7)的作用,因此被认为是RAS系统中治疗心血管疾病的一个潜在治疗靶点。Ang(1-7)作为AngⅡ的内源性拮抗因子,在心血管系统中发挥着重要生物学作用,例如改善心脏功能、扩张血管、抗心律失常、降低血压等。Crackower等人首次报道了敲除ACE2基因的小鼠会出现严重的心肌收缩功能障碍;在心肌梗死或者糖尿病心肌病的大鼠模型中,过表达ACE2基因可减少心肌间质胶原沉积,从而改善左室重构和功能障碍。其他研究也表明ACE2/Ang(1-7)/Mas受体轴参与心脏的生理过程及心力衰竭的病理过程。.ACE2是近年来新发现的一种羧肽酶,属于ACE同工酶,其中42%的催化结构域与ACE相同。它能够将AngⅠ转化为Ang(1-9),亦能够高效的将AngⅡ转化为Ang(1-7)。既往很少有研究报道过表达ACE2基因对ACM的直接影响,本研究拟在ACM大鼠模型的基础上采用直接心内注射ACE2腺病毒载体的方法增加大鼠体内ACE2的活性,观察ACE2基因直接心内转染或者ACEI如西拉普利对ACM的影响,并探讨其治疗作用的可能分子机制。2目的(1)用Wistar大鼠建立ADR诱导的心肌病动物模型;(2)观察ACE2基因和西拉普利治疗在大鼠ACM中的作用;(3)探讨ACE2基因保护ACM的分子机制。3方法3.1构建ACE2过表达腺病毒载体应用(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,按引物 ACE2 F:5 '-GAAAGTTGCTCAGTGGATGGGAT-3';R:5 '-TTTGCTAAAAGGAAGTCTGAGCATC-3',从小鼠肾脏组织RNA中扩增出小鼠ACE2基因的cDNA序列,克隆到pMD18-T载体,之后再亚克隆到pDC316载体中,构建穿梭质粒(pDC316-ACE2)。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组,形成重组腺病毒载体,然后将重组腺病毒质粒转染到293细胞中包装成Ad-ACE2。3.2动物模型的建立190只8-10周龄(体重250-300克)雄性Wistar大鼠,分为对照组(20只)和治疗组(170只)。治疗组大鼠给予腹腔内注射ADR 2.5mg/kg(用高压灭菌的三蒸水溶解),隔日1次,共计6次,累积剂量为15mg/kg。对照组给予同等剂量的三蒸水。在注射ADR的2周期间,治疗组大鼠死亡10只,然后将治疗组剩余大鼠随机分为4组(每组40只):模型组、Ad-EGFP组、Ad-ACE2组和西拉普利组。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉,气管切开连接动物呼吸机,打开胸腔,充分暴露心脏,打开心包。Ad-ACE2组大鼠用30号针在左心室壁穿刺6个部位,深度约1-2mm,然后直接注射总体积为200μlACE2腺病毒载体(2×109pfu),Ad-EGFP组注射等体积等滴度的EGFP腺病毒载体,而模型组注射200μl的无菌生理盐水。手术结束后,大鼠继续给予普通饮食喂养。西拉普利组大鼠通过灌胃给予10mg/kg/day西拉普利治疗4周。病毒注射2周后,每组取8只大鼠给予安乐死,测定ACE2基因的转染效率,剩余大鼠继续喂养2周至实验结束,所有大鼠予以安乐死。3.3血压测量在实验结束后,用鼠尾血压测量仪测量所有大鼠的血压和心率,每只大鼠测量3次后取其血压和心率平均值。3.4心脏超声检查大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉，连接肢体导联进行心电图监测,选用RMV710B探头,以二维以及M型超声于左室长轴或短轴检测以下指标:左室舒张末期直径(LVEDD)和容积(LVEDV)以及左室收缩末期直径(LVESD)和容积(LVESV)。左室缩短分数(FS;%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100。左室射血分数(LVEF;%)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV× 100。3.5 RT-PCR留取大鼠的心肌组织提取总的RNA,采用RT-PCR方法检测ACE2的mRNA表达。3.6 免疫印迹(western blot)留取大鼠的心肌组织提取总蛋白,进行western blot检测ACE2、ACE、CollegenⅠ、Collegen Ⅲ、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、AMPK、ERK、PI3K、AKT、Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、MMP-1、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 蛋白表达。3.7组织病理学检测实验结束后,大鼠予以安乐死,留取心肌组织,进行HE染色和Masson染色;免疫组织化学方法检测心肌组织中ACE2、Ⅰ型和Ⅲ型胶原、VCAM-1和TNF-α的含量。3.8 TUNEL 染色利用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡。3.9酶联免疫吸附测定(EL ISA)取新鲜的心肌组织,放入含有蛋白酶抑制剂Cocktail的IMDM培养基中经超声震碎形成组织匀浆,离心后留取上清液用于检测;血液同样放入含有蛋白酶抑制剂Cocktail的促凝管中,离心后留取血浆用于检测。取组织上清液和血浆进行 AngⅡg(1-7)ELISA 检测。3.10 ACE2活性的测定提取心肌组织蛋白,ACE2能分解7-Mca-YVADAPK(Dnp)-OH反应底物的C末端的2,4-二硝基苯基部分,从而促使荧光增强。使用酶标仪检测激发光为320 nm以及散射光为400 nm时的荧光强度,动态检测荧光强度4个小时。ACE2活性=无ACE2抑制剂时的荧光强度-存在ACE2抑制剂DX600时的荧光强度。3.11 SOD活性的测定留取大鼠的心肌组织提取总蛋白,测定蛋白浓度,根据SOD活性检测试剂盒说明,在激发波长为550 nm用酶标仪检测SOD各样品的吸光度数值,SOD活性=[(对照管吸光度-样品管吸光度)/对照管吸光度]÷0.5×(反应液的总体积/取样量)÷待测样品的蛋白浓度。4结果4.1大鼠的一般情况和死亡率与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组大鼠均出现皮毛粗糙失去光泽、腹泻、眼睛周围红色分泌物、腹部肿大、腹水等现象,然而Ad-ACE2组大鼠无上述症状,西拉普利组大鼠仅表现轻度的上述症状。从腺病毒注射到4周实验结束开始计算,模型组、Ad-EGFP组、Ad-ACE2组、西拉普利组大鼠的死亡率分别为71.88%、75.00%、18.75%、46.88%。对照组大鼠未发现死亡。与模型组和Ad-EGFP组相比,Ad-ACE2组和西拉普利组大鼠的死亡率明显的下降。Ad-ACE2组大鼠的死亡率显著低于西拉普利组。4.2 ACE2的转染效率在病毒转染后2周观察大鼠心肌组织内ACE2的转染效率,与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组大鼠心肌组织中ACE2 mRNA和蛋白表达水平以及活性显著增高,而模型组与Ad-EGFP组大鼠心肌组织中ACE2的含量无明显差别。与模型组和Ad-EGFP组相比,过表达ACE2或西拉普利治疗显著增加了 ACE2 mRNA和蛋白表达水平以及活性;而且西拉普利组大鼠心肌组织中ACE2的含量显著低于Ad-ACE2组。4.3 HE染色对照组心肌组织可见心肌细胞排列整齐,胞核大小均一,无心肌纤维破坏,细胞间隙正常。模型组和Ad-EGFP组心肌细胞肥大,心肌纤维断裂,炎症侵润。Ad-ACE2组和西拉普利组的上述病理学改变较模型组和Ad-EGFP组明显减轻,然而西拉普利组减轻的程度不如Ad-EGFP组。4.4心肌中ACE2和ACE的表达在病毒转染4周实验结束后,Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组ACE2的表达仅轻度增加,无统计学差异;与模型组Ad-EGFP组和西拉普利组相比,Ad-ACE2组ACE2的表达则显著增加。模型组和Ad-EGFP组ACE的表达明显高于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组,模型组与Ad-EGFP组或者Ad-ACE2组与西拉普利组相比无统计学意义。4.5心肌和血浆中Ang(1-7)和AngⅡ的水平ELISA检测结果显示,与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组大鼠心肌和血浆中的Ang(1-7)和AngⅡ的水平均显著增加,模型组与Ad-EGFP组相比无明显差异;与模型组和Ad-EGFP组相比,Ad-ACE2组和西拉普利组大鼠心肌和血浆中的Ang(1-7)的水平可进一步显著增加,而AngⅡ的水平则显著降低;与西拉普利组相比,ACE2过表达使大鼠心肌和血浆中的Ang(1-7)的水平明显增加,而AngⅡ的水平则显著降低4.6 TUNEL染色以及c-caspase3和Bcl-2蛋白表达TUNEL染色结果显示,与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组大鼠心肌组织中TUNEL染色阳性细胞相对含量显著增高,而模型组与Ad-EGFP组差别无统计学意义。与模型组和Ad-EGFP组相比,Ad-ACE2组和西拉普利组大鼠心肌组织中TUNEL染色阳性细胞相对含量则明显降低,而Ad-ACE2组与西拉普利组差别无统计学意义。模型组和Ad-EGFP组c-caspase3的蛋白表达明显高于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组;模型组与Ad-EGFP组或者Ad-ACE2组与西拉普利组c-caspase3的蛋白表达无明显差异。与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组Bcl-2的蛋白表达明显减低,模型组与Ad-EGFP组相比无明显差异;Ad-ACE2组和西拉普利组Bcl-2的蛋白表达较模型组和Ad-EGFP组明显增加;而相比于西拉普利组,ACE2过表达使大鼠心肌组织中Bcl-2的蛋白表达显著增加。4.7 AMPK的蛋白表达与模型组和Ad-EGFP组相比,ACE2过表达和西拉普利处理可显著增加AMPK的磷酸化;而相比于Ad-ACE2组,西拉普利处理使大鼠心肌组织中AMPK的磷酸化显著降低。4.8炎症因子的表达免疫组化结果显示,Ad-ACE2组和西拉普利组VCAM-1及TNF-α的表达较模型组和Ad-EGFP组显著降低;而与西拉普利组相比,Ad-ACE2组VCAM-1及TNF-α的表达明显的增多。Western blot检测结果同样显示,模型组和Ad-EGFP组ICAM-1、VCAM-1及TNF-α表达明显高于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组;模型组与Ad-EGFP组或者Ad-ACE2组与西拉普利组ICAM-1的表达无明显差异。4.9 NOX2、P47和iNOS的表达及SOD活性Western blot检测结果显示模型组和Ad-EGFP组NOX2和P47的表达明显高于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组,模型组与Ad-EGFP组相比无统计学意义;与西拉普利组相比,Ad-ACE2组P47的表达明显降低,而NOX2的表达无明显差异。模型组和Ad-EGFP组SOD的活性明显低于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组,模型组与Ad-EGFP组SOD的活性无明显差别;与西拉普利组相比,Ad-ACE2组SOD的活性显著降低。Western blot检测结果显示,Ad-ACE2组和西拉普利组iNOS的表达较模型组和Ad-EGFP组显著降低,模型组与Ad-EGFP组或者Ad-ACE2组与西拉普利组相比无统计学意义。4.10 ERK的蛋白表达Western blot检测结果显示,与模型组和Ad-EGFP组相比,ACE2过表达和西拉普利处理可显著减低ERK的磷酸化,而模型组与Ad-EGFP组或者Ad-ACE2组与西拉普利组相比无统计学意义。4.11 PI3K和AKT的蛋白表达Western blot检测结果显示,与对照组、模型组和Ad-EGFP组相比,ACE2过表达和西拉普利处理可显著增加PI3K和AKT的磷酸化,而相比于Ad-ACE2组,西拉普利处理使大鼠心肌组织中AMPK的磷酸化显著降低。4.12心率、血压及心脏超声测定结果各组间大鼠的心率无显著差异。与对照组相比,其余各组大鼠血压均显著降低,但Ad-ACE2组及西拉普利组大鼠血压与模型组及Ad-EGFP组相比无差别。心脏超声测定结果显示,与模型组和Ad-EGFP组相比,Ad-ACE2组和西拉普利组LVESD和LVEDD显著降低,而LVEF和FS则显著增加;相比于西拉普利组,Ad-ACE2组LVEF和FS显著增加,左室舒张末期直径则显著降低。4.13胶原的表达Masson染色显示,与模型组和Ad-EGFP组相比,而ACE2过表达和西拉普利处理可显著减低胶原沉积;而相比于西拉普利组,ACE2过表达使大鼠心肌组织中的胶原沉积更加显著降低;模型组与Ad-EGFP组间无统计学意义。免疫组化和western blot检测结果均显示模型组和Ad-EGFP组Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达明显高于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组,模型组与Ad-EGFP组相比无统计学意义;与西拉普利组相比,ACE2过表达可显著降低大鼠心肌组织中的Ⅲ型胶原的表达,而对Ⅱ型胶原的表达无明显影响4.14 MMP-9、MMP-1、TIMP-1、TIMP-2 和 TGF-β 1 的表达Western blot检测结果显示,与对照组相比,模型组和Ad-EGFP组MMP-9的表达显著增加,而模型组与Ad-EGFP组MMP-9的表达无明显差异;与模型组和Ad-EGFP组相比,Ad-ACE2组和西拉普利组MMP-9的表达增加更加显著,Ad-ACE2组与西拉普利组相比无统计学意义。各组间大鼠心肌组织中MMP-1、TIMP-1以及TIMP-2的表达无统计学意义。Western blot检测结果显示模型组和Ad-EGFP组TGF-β1的表达明显高于对照组、Ad-ACE2组和西拉普利组,而模型组与Ad-EGFP组相比无统计学意义;与西拉普利组相比,Ad-ACE2组TGF-β1的表达明显降低。5结论(1)ACE2基因治疗明显改善ACM心肌重构和收缩功能障碍以及降低ACM大鼠的死亡率;(2)ACE2基因治疗发挥心脏保护作用的分子机制包括ACE2抑制心肌细胞凋亡、炎症反应、氧化应激以及心肌纤维化;活化AMPK、PI3K和AKT的磷酸化;抑制ERK1/2的磷酸化及TGF-β1表达;降低心肌组织中AngⅡ含量而增加Ang(1-7)的含量;(3)ACE2基因对ACM的治疗效果优于西拉普利。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.16

【参考文献】