穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响

发布时间：2018-03-11 07:46

  本文选题：多囊卵巢综合征　切入点：胰岛素抵抗　出处：《广州中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：观察穴位埋线对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR)模型大鼠生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响,从miRNA调控生殖内分泌和胰岛素信号通路探讨穴位埋线治疗PCOS的作用机理。本研究包括文献研究和实验研究两部分,首先从文献研究角度论述了多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展,再从实验研究角度对穴位埋线干预PCOS-IR模型大鼠的疗效及作用机制进行了较为深入的研究。方法：1文献研究全面检索近年来与PCOS-IR有关的国内外文献报道,并进行较为系统的总结和综述,进而掌握了有关PCOS-IR研究及穴位埋线研究的前沿动态。主要包括以下3个方面：(1)多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展；(2)多囊卵巢综合征胰岛素抵抗动物模型的研究进展：(3)针灸改善多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展。2实验研究(1)来曲唑配合高脂膳食诱导多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠模型：将24只3w龄雌性SD大鼠随机分为4组：PCOS-IR组(6只),PCOS组(6只),高脂组(6只)和对照组(6只),PCOS-IR组予高脂饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃来曲唑CMC-Na溶液,连续9w；PCOS组常规饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃来曲唑CMC-Na溶液,连续9w；高脂组予高脂饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液,连续9w；对照组常规饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液,连续9w。观察大鼠体重、动情周期、卵巢组织学变化,测定血清性激素、血脂水平、糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖(FPG)和空腹胰岛素(FINS)浓度,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。(2) PCOS-IR模型大鼠卵巢组织miRNA差异表达谱分析研究：随机从PCOS-IR模型组及正常对照组中各选取3只大鼠,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉下取一侧卵巢,液氮冷冻保存,由北京博奥晶典生物技术有限公司提供芯片筛选差异microRNAs实验服务；根据基因芯片筛选结果并进一步采用目前常用的比较公认的9款miRNA靶基因预测软件:DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22以及TargetScan进行靶基因预测,选择同时被上述数据库中3个或3个以上数据库预测为阳性的靶基因,结合靶基因预测结果,选择与PCOS生殖内分泌紊乱及胰岛素抵抗相关的miR-598和miR-125b进行real-time PCR验证。(3)穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠miR-125b调控生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响：PCOS-IR模型大鼠随机分为穴位埋线组(n=8)、假穴位埋线组(假埋线组,n=6)、模型对照组(n=6)、和二甲双胍组(n=8),另设空白对照组(n=6)。穴位埋线组于105日龄起行穴位埋线治疗(穴位处方一：关元、三阴交(双);穴位处方二：肾俞9双)、脾俞9双)、肝俞9双)),穴位埋线每5天1次,两组穴位交替,共治疗20天),假穴位埋线组大鼠给予埋线组相同的抓取、乙醚麻醉、固定、穴位剪毛、消毒,选穴及埋线操作同穴位埋线组,但埋线针管中不放置羊肠线,即穴位内不植入羊肠线；模型组：大鼠给予埋线组相同的抓取、固定、穴位剪毛、消毒,不做其他任何治疗；空白对照组：大鼠给予埋线组相同的抓取、固定、穴位剪毛、消毒,不做其他任何治疗；二甲双胍组：二甲双胍片捣碎溶解于双蒸水中,灌胃前摇匀,大鼠每天灌胃给药(剂量200mg/kg. d),连续治疗20天。各组大鼠治疗后观察体重、体长、Lee's指数、卵巢组织学变化,放射免疫分析方法检测血清性激素水平、血脂水平、糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖(FPG)和空腹胰岛素(FINS)浓度并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR), real-time PCR检测卵巢组织miR-125b, FSHR、LHR、P450c17a、INSR、ERK1、ERK2mRNA表达,western blot检测大鼠卵巢组织INSR、ERK1、ERK2蛋白表达水平及磷酸化水平。结果：(1)PCOS-IR组与PCOS组大鼠阴道涂片HE染色镜检结果显示均处于动情间期时相,仅见大量白细胞,偶见少量角化细胞,提示无排卵；高脂组、对照组仍保持规律的动情周期;PCOS-IR组和PCOS组卵巢呈多囊样改变,卵巢闭锁卵泡增多,闭锁卵泡的直径较大,颗粒细胞层数有所减少,白膜增厚,无成熟卵泡,未见黄体分布；高脂组及对照组卵巢分布有各级卵泡,可见较多黄体分布；与对照组相比,PCOS-IR组大鼠的血清睾酮(T)水平显著升高(P0.01)、黄体生成素(LH)水平明显升高(P0.05)、卵泡刺激素(FSH)水平明显下降(P0.05)、泌乳素(PRL)水平显著升高(P0.01),雌二醇(E2)水平明显下降(P0.05)、孕酮(P)水平显著下降(P0.001),体重显著增加(P0.001),血清总胆固醇(TC)水平明显升高(P0.05)、低密度脂蛋白(LDL)显著升高(P0.01),糖耐量曲线下面积(AUC)显著增加(P0.05),胰岛素耐量AUC显著增加(P0.01),血清空腹胰岛素(FINS)水平显著升高(P0.05),胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著升高(P0.05)。(2) PCOS-IR模型组和对照组卵巢组织中Fold Change值1.5,P0.05的差异表达miRNA 共 20个,14个miRNA在PCOS-IR模型组中上调、6个miRNA下调。其中上调最显著的是rno-miR-3585-5p、rno-miR-509-5p、rno-miR-218a-5p、 rno-miR-598-3p(以下简称miR-598)等,分别上调702.0倍、342.8倍、273.2倍及232.1倍,而下调差异最显著的分别rno-miR-31a-5p、rno-miR-185-5p、 rno-miR-126a-3p、rno-mir-125b-5p(以下简称miR-125b)等,分别下调1090.2倍、3.0倍、2.3倍及1.6倍。靶基因预测显示上调miRNA预测到7869个靶基因,下调miRNA预测到4779个靶基因,其中与PCOS生殖内分泌调节及胰岛素抵抗相关的miR-598和miR-125b通过real-time PCR技术进一步验证结果显示：PCOS-IR模型组miR-125b表达量相对对照组的表达量与芯片结果相当,表明芯片结果是可靠的,miR-125b参与PCOS-IR的发生；而miR-598定量PCR结果与芯片结果趋势相反。(3)穴位埋线组、二甲双胍组大鼠治疗后卵巢形态学镜检可见不同发育阶段的卵泡及多个黄体,大鼠恢复排卵、卵泡发育正常,假穴位埋线组与模型组大鼠卵巢囊状卵泡和闭锁卵泡增多,卵巢呈多囊样改变,颗粒细胞层数减少,白膜增厚,无成熟卵泡,无黄体和白体分布；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组大鼠治疗后血清LH水平明显降低(P0.05)、T水平显著降低(P0.01)、PRL水平显著降低(P0.01)、FSH水平显著升高(P0.01)、E2水平显著升高(P0.01)、P水平明显升高(P0.05)；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组大鼠治疗后卵巢miR-125b表达量显著提高(P0.001)、FSHRmRNA表达量显著降低(P0.001)、LHRmRNA表达量显著降低(P0.001)、P450c17 α mRNA表达量显著降低(P0.01)；miR-125b的表达量与FSHR、LHR、P450c17αmRNA表达量成负相关,相关系数分别为-0.814、-0.826、-0.823(P值均0.001)。(4)与假穴位埋线组、模型对照组相比,穴位埋线组及二甲双胍组治疗后大鼠体重增加速度明显减缓(P0.01),Lee's指数明显降低(P0.001)；血清FINS及HOMA-IR显著降低(P0.01)、糖耐量曲线下面积明显降低(P0.05);血清总胆固醇水平显著降低(P0.01),血清低密度脂蛋白显著降低(P0.01),穴位埋线组与二甲双胍治疗组差异无统计学意义；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组治疗后,大鼠卵巢组织miR-125b表达量显著提高(P0.001)、ERK1mRNA表达量明显降低(P0.01)、ERK2mRNA表达量显著下调(P0.001)。miR-125b的表达量与ERK1、ERK2mRNA表达量成负相关,相关系数分别为-0.850、-0.689(P值均0.001),miR-125b的表达量与INSRmRNA表达量无显著相关；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组治疗后,大鼠卵巢组织INSR蛋白表达无显著改变,但INSR磷酸化比例明显升高(P0.01),ERKl、ERK2蛋白表达下调(P0.001),磷酸化比例明显降低(P0.001)。结论：(1)来曲唑灌胃配合高脂膳食喂养雌性SD大鼠可成功诱导PCOS-IR动物模型,该模型避免了其他造模方法皮下注射或皮下埋植给药方式对针灸疗法效应的干扰,可以作为一种适宜针灸疗法研究的PCOS-IR动物模型。(2)PCOS-IR模型大鼠卵巢组织miR-125b下调表达,靶向调控FSHR、ERK、INSR和AKT等生殖内分泌、胰岛素信号通路相关基因异常表达,为进一步探讨穴位埋线改善PCOS-IR模型大鼠生殖内分泌及胰岛素抵抗的表观遗传作用机制研究提供了依据。(3)穴位埋线能够明显改善PCOS-IR大鼠生殖内分泌紊乱,促进卵泡正常发育和排卵;其机理在于穴位埋线下调PCOS-IR模型大鼠卵巢LHR和P450c17 α mRNA的表达,降低雄激素水平,解除高雄激素血症对miR-125b表达的抑制,使miR-125b表达上调,miR-125b进一步通过负调控途径降低其靶基因FSHRmRNA表达,在转录后水平改善卵巢对FSH的高反应,促进卵泡正常发育。(4)穴位埋线能明显改善PCOS-IR模型大鼠胰岛素抵抗,提高卵巢miR-125b的表达,miR-125b通过负向调控降低其靶基因ERK1、ERK2高表达,下调MAPK/ERK通路的异常活化,恢复颗粒细胞增殖与凋亡的平衡,降低卵泡膜细胞过多合成雄激素,可能是穴位埋线改善PCOS胰岛素抵抗进而改善生殖内分泌的表观遗传转录后作用机制。
[Abstract]:鐩�鐨勶細瑙傚療绌翠綅鍩嬬嚎瀵瑰�氬泭鍗靛发缁煎悎寰佽儼宀涚礌鎶垫姉(PCOS-IR)妯″瀷澶ч紶鐢熸畺鍐呭垎娉屽拰鑳板矝绱犳姷鎶楃殑褰卞搷,浠巑iRNA璋冩帶鐢熸畺鍐呭垎娉屽拰鑳板矝绱犱俊鍙烽，

本文编号：1597225