抑制STAT3信号通路活化对LPS诱导的ARDS炎症反应保护作用的机制研究

发布时间：2018-03-11 07:50

本文选题：急性呼吸窘迫综合征　切入点：STAT3　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的病理基础是各种肺内外原因(包括直接原因和间接原因)导致的肺泡-毛细血管通透性增加,进而引起肺不张及过度失控的肺部炎症反应,导致急性、进行性加重的呼吸衰竭,其病死率可高达30%-60%。在ARDS的早期阶段,单核-巨噬细胞系统被激活,释放炎症细胞因子如白介素-1β (interleukin-1, IL-1β、 IL-8、肿瘤坏死因子-αα(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等,在这些炎症细胞因子的作用下,中性粒细胞和内皮细胞等被激活,进而引起肺组织中大量的炎症细胞(包括中性粒细胞和巨噬细胞)浸润及激活,启动炎症反应的级联反应,而且可以使炎症反应部位血管内皮细胞黏附分子的表达增加,最终导致肺组织损伤。JAK-STAT是近年来新发现的一条细胞内信号转导途径。研究表明许多细胞因子(IFN、IL-2、IL-4、IL-6、 CNTF等)和生长因子(EGF、PDGF、CSF等)都利用该信号转导途径诱导细胞的增殖、分化或凋亡,它们在免疫功能调节、造血细胞生成、肿瘤发生及神经和胚胎发育中发挥着既特异又有多效性的生物学功能。信号传导蛋白和转录激活物(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)可通过介导炎症介质的细胞外信号调控免疫细胞的生物学行为,是炎症形成过程中不可或缺的关键性分子。STAT3信号通路的激活可活化巨噬细胞,进而促进炎性细胞因子和趋化因子的产生,加重ARDS的疾病进程。STAT3的特异性抑制剂LLL12,是STA-21的衍生物。可特异性与STAT3中的tyrosine 705(Y705)结合,阻止STAT3信号通路活化及其下游的反应,进而可使细胞因子、粘附分子、趋化因子的表达减少,抑制中性粒细胞等炎性细胞在肺内的聚集。本研究探讨在小鼠ARDS过程中,应用STAT3抑制剂LLL12和条件性敲除STAT3活化的负调节因子(SOCS3)后,观察STAT3的活化程度,以及肺组织炎症细胞浸润及炎症细胞因子表达的变化,以明确STAT3的激活在ARDS中的促炎作用,从而为治疗ARDS提供新的思路和理论基础。研究方法动物模型的建立及分组鼻内滴入50ul LPS(100mg/kg)建立C57BL/6小鼠、SOCS3fl/fl小鼠、LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠ARDS模型,随机分对照组(UN组)、脂多糖组(LPS组)、LLL12干预组(LPS+LLL12组)。于鼻内滴入LPS前2小时腹腔内注射LLL12(5mg/kg)来实现对小鼠ARDS的干预。UN组腹腔内注射20ml/kg的生理盐水。标本的采集：每组小鼠于造模后24h、48h、72h及96h吸入异氟烷(100mg/Kg)麻醉。并采集血液和BALF,留肺组织行HE染色,检测血液及BALF中炎症细胞以及血清和BALF中细胞因子表达的变化。体外培养巨噬细胞,分别给予LPS、LPS和LLL12刺激,检测STAT3、STAT1、NF-κB以及ERK1/2的磷酸化程度同时检测TNF-α、IL-1β和iNOS的表达情况。检测方法及指标：1.HE染色评估肺组织病理损伤及评分,同时测定肺泡-动脉氧分压差及肺湿干重比值(W/D)。2.取BALF细胞沉渣,进行流式细胞学,计数单核白细胞总数及CDllb+CD45+和CDllb+/CDllc+的比例,同时检测STAT3的磷酸化程度。3.收集BALF上清液及备用血清,ELISA法检测]fNF-α、IL-1β及CCL2的水平。4.采用实时逆转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)方法检测巨噬细胞中细胞因子的表达。5.采用Western Blot方法检测巨噬细胞中STAT3信号通路的活化情况。研究结果：1.一般情况：UN组小鼠呼吸平稳,解剖后肺部外观色泽粉红；LPS组小鼠呼吸急促,口唇发绀,解剖后肺体积增大,色泽暗红或紫红,脏层胸膜下点状、片状出血,与SOCS3fl/fl小鼠的一般情况相比,LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠的呼吸、进食、活动能力及肺组织的体积和出血情况均明显加重：LPS+LLL12组小鼠均可见呼吸急促减轻,解剖后肺体积无明显增大,色泽呈红色,表面见少许散在的出血点,包膜张力减轻。2.肺组织病理损伤及评分2.1 HE染色：UN组肺组织结构完整正常；LPS组部分肺泡壁不同程度的破坏或断裂,肺微血管充血、出血、微血栓形成,肺泡腔及肺间质内见大量炎性细胞浸润、I型肺泡上皮细胞坏死,与SOCS3fl/fl小鼠肺组织病理变化比较,LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠肺组织的上述病理变化在各时间点均明显加重；LLL12干预后肺组织损伤程度减轻。2.2肺病理评分：LPS组肺组织病理评分明显高于UN组,LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠病理评分明显高于SOCS3fl/fl小鼠；LLL12干预后病理评分较LPS组下降,病理评分与HE染色肺组织损伤的动态变化趋势相似。3.肺泡-动脉氧分压差P(A-a)O2各时相LPS组P(A-a)O2明显高于UN组,差异有统计学意义(P0.01),LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠P(A-a)O2明显高于SOCS3fl/fl小鼠(P0.01),LLL12干预后,随着时间延长,肺组织氧合得到部分改善,与LPS组比较P(A-a)O2逐渐减少(P0.05),但仍明显高于UN组。4.肺组织湿/干重比值(W/D)LPS组肺组织W/D比值明显高于UN组(P0.01),LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠W/D比值明显高于SOCS3fl/fl小鼠(P0.01); LLL12干预后W/D比值较LPS组下降,与肺损伤病理评分的动态变化趋势相似。5. BALF中白细胞总数及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+勺比例：LPS组白细胞总数及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+比例较UN组进行性增加；与LPS组对比,LLL12干预后白细胞总数及CD11b+CD45+和CDllb+/CD11c+比例下降。6.血清及BALF中TNF-α、IL-1β及CCL2的表达LPS组血清及BALF中’TNF-α、IL-1β及CCL2的浓度明显高于UN组,LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠中各炎症细胞因子的增加幅度更为显著；LLL12干预后TNF-α、IL-1β及CCL2的浓度在24h、48h、72h及96h均低于LPS组,而在48h明显低于LPS组,差异有显著意义(P0.01),但均高于UN组。7. Western blot检测巨噬细胞中STAT3的磷酸化水平LPS刺激体外培养的巨噬细胞,STAT3的磷酸化水平增高,来源于LysMCr e-SOCS3fl/fl小鼠的巨噬细胞中STAT3活化程度明显增强；而应用LLL12抑制STAT3的磷酸化后,TNF-α、IL-1β和iNOS的表达均降低。结论1.LPS诱导的ARDS中,STAT3信号通路的激活,中性粒细胞和巨噬细胞在肺内的聚集增加,细胞因子(fNF-α、IL-1β)及趋化因子(CCL2)表达增加。2.LLL12通过抑制STAT3的激活,下调细胞因子及趋化因子的表达,减少中性粒细胞和巨噬细胞的聚集,肺组织损伤减轻,为ARDS的治疗提供新的思路和理论基础。3.条件性敲除STAT3活化的负调节因子(SOCS3)后,与野生型小鼠比较,LPS诱导的ARDS的炎症反应明显增强,表明SOCS3可通过抑制STAT3信号通路的激活在ARDS发生发展中发挥保护作用。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8

【参考文献】