HMGB1募集MDSC对结直肠癌术后腹腔种植影响的研究

发布时间：2018-03-11 22:37

  本文选题：手术创伤　切入点：高迁移率族蛋白1　出处：《华中科技大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 结直肠癌已成为第三大癌症发生和死亡原因,手术切除仍然是可能治愈结直肠癌的唯一治疗方法,然而结直肠癌的术后复发还是临床亟待解决的问题。手术在治疗肿瘤的同时也常常带来创伤,手术创伤可释放多种损伤相关分子模式分子包括HMGB1,同时也通过多种机制引起免疫抑制,而免疫抑制如MDSC与肿瘤的进展密切相关。结直肠癌手术创伤对肿瘤腹腔种植复发的影响还不清楚。本研究旨在通过动物肿瘤手术模型探索手术创伤在结直肠肿瘤腹腔局部复发中作用。 方法： 通过腹部手术模拟结直肠肿瘤的手术创伤,收集术后24小时腹腔渗液,用HMGB1的ELISA试剂盒检测HMGB1水平；给于外源性HMGB1注射小鼠腹腔三次,每天一次,收集腹腔灌洗液,流式检测MDSC在CD45中的比例和计数MDSC在灌洗液中的数量；体外培养结肠癌细胞系CT26,皮下种植CT26细胞,制造小鼠负瘤模型；两周后麻醉小鼠,剥除肿瘤并制造腹腔内手术损伤,模拟腹腔肿瘤切除手术。用HMGB1Box-A阻断HMGB1,用Gemcitabine清除MDSC,收集小鼠腹腔灌洗液,流式检测腹腔灌洗液中MDSC的比例和数量；给HMGB1阻断组、Gemcitabine去除组、单纯手术组和对照组腹腔创伤小鼠种植CT26细胞,两周后对肿瘤种植负荷评分。收集HMGB1阻断、Gemcitabine去除组、单纯手术组和对照组腹腔创伤术后腹腔中MDSC,分别用DAF-FM DA荧光探针和DCFH-DA荧光探针标记MDSC,流式检测NOS活性和ROS水平。应用NOS抑制剂(L-NAME)和ROS清除剂(Tiron)注射创伤术后腹腔,同时腹腔种植CT26,两周后进行腹腔肿瘤种植评分,评估L-NAME和Tiron对CT26腹腔种植的影响。 结果： 正常小鼠手术后腹腔渗液的HMGB1浓度平均为4237.67ng/ml,负瘤小鼠手术后腹腔渗液的HMGB1浓度平均为3300.67ng/ml,负瘤小鼠无手术时,腹腔液中HMGB1浓度平均为53.97ng/ml。正常小鼠腹腔中只有很少量的MDSC存在,只占CD45阳性细胞的2%左右,而腹腔中只有数量有限的MDSC,约为2.4×10^3个MDSC细胞；100ng/ml HMGB1处理组小鼠腹腔中MDSC比例占CD45阳性细胞的10%,lml腹腔灌洗液含有MDSC数量为3.9×10^4；1000ng/ml HMGB1处理组小鼠腹腔中MDSC比例占CD45阳性细胞的30%,lml腹腔灌洗液中有1×10^5左右个MDSC细胞,与对照组相比此差异具有统计学意义(p0.05)。HMGB1拮抗剂HMGB1Box-A处理后,小鼠腹腔灌洗液中MDSC占CD45阳性细胞比例为12%,lml小鼠腹腔灌洗液中MDSC数量为0.75×10^6；单纯手术组小鼠腹腔灌洗液中MDSC比例为73%,1ml小鼠腹腔灌洗液中MDSC可达6.0×10^6,另外术前给以Gemcitabine去除小鼠体内的MDSC后,趋化至小鼠腹腔中MDSC比例约为28%,lml小鼠腹腔灌洗液中MDSC数量减少为1.3×10^6；负瘤小鼠无手术组,小鼠腹腔灌洗液中MDSC比例为2.3%,lml小鼠腹腔灌洗液中MDSC为2.0×10^3。小鼠腹膜肿瘤种植评分结果显示非手术组、HGMB1Box-A处理组、Gemcitabine组和手术组小鼠壁层腹膜肿瘤种植总评分分别为：2.0±1.0,5.0±1.0,7.3±3.0和10.4±3.5,组内比较差异具有统计学意义(p=0.008)；而总的腹腔种植转移评分分别为：6.7±1.5,11.0±1.0,13.5±3.8和18.8±3.5,组内比较差异有统计学意义(p=0.001)。同时,腹腔种植肿瘤病灶的最大直径分别为：0.3±0.1cm、0.3±0.1cm,0.5±0cm和0.8±0.3cm,组内比较差异具有统计学意义(p=0.013)。NOS和ROS活性检测结果显示手术创伤募集的MDSC中DAF-FMDA探针荧光强度较无手术组明显增加,而Gecitabine和]HMGB1Box-A组DAF-FMDA探针荧光较手术组减弱；手术组与Gemcitabine处理组和无手术组小鼠腹腔灌洗液的MDSC中DCFH-DA探针荧光强度差异不大,而手术组与HMGB1Box-A处理组小鼠腹腔灌洗液的MDSC中DCFH-DA探针荧光强度有显差异。然而,HMGB1Box-A处理组较无手术组小鼠腹腔灌洗液的MDSC中DCFH-DA探针荧光强度也明显减弱。用NOS和ROS抑制剂干预后,评估肿瘤腹腔种植转移负荷结果显示手术组、Tiron处理组和L-NAME组小鼠壁层腹膜肿瘤种植总评分分别为：8.5±1.3,6.3±3.7和4.8±1.3,组内比较差异不明显(p=0.134)；而总的腹腔种植转移评分分别为：16.3±1.0,12.3±3.7和9.7±1.5,组内比较差异有统计学意义(p=0.011)。同时,腹腔种植肿瘤病灶的最大直径分别为：0.7±0.1cm、0.5±0.1cm和0.5±0.1cm,组内比较差异具有统计学意义(p=0.044) 结论： 我们通过动物肿瘤手术模型研究表明手术创伤导致损伤组织释放损伤相关分子HMGB1,HMGB1可以募集大量的髓系来源免疫抑制性细胞MDSC趋化至腹腔,阻断HMGB1可抑制MDSC的趋化,减轻结肠癌细胞CT26腹腔种植,腹腔术后趋化的MDSC通过产生NOS促进结肠癌细胞种植灶的形成和生长,通过产生ROS促进CT26肿瘤种植灶的增大。
[Abstract]:Objective:
Colorectal cancer has become the third largest cause of death and cancer, surgical resection is still the only treatment may cure colorectal cancer, however, colorectal cancer recurrence or clinical problems. Surgery in the treatment of tumor and often bring trauma, surgical trauma can release a variety of damage associated molecular patterns including molecular HMGB1 at the same time also caused by a variety of mechanisms of immune suppression and immune suppression, advances such as MDSC and tumor is closely related to the effect of trauma surgery for colorectal cancer on tumor peritoneal recurrence is unclear. The purpose of this study is through animal tumor model to explore surgical trauma in local recurrence of colorectal cancer in the abdominal cavity.
Method锛，

本文编号：1600265