谷氨酰胺和益生菌联合应用对大鼠烧伤后肠道的保护作用及机制研究

发布时间：2018-03-13 00:05

本文选题：烧伤　切入点：谷氨酰胺　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：严重烧伤能够引发肠道炎症和氧化应激,引起肠道损伤,最终导致肠道屏障破坏及肠道功能紊乱。研究发现单独应用谷氨酰胺(Glutamine,Gln)或益生菌(probiotics)都能降低肠道炎症和肠道损伤。已有的研究认为谷氨酰胺能给肠道补充营养并能抑制机体的氧化应激和炎症反应,而益生菌能够调整肠道微生态并起到保护肠道及抑制肠道炎症反应的作用,但是其相关详细机理尚未明确。联合应用谷氨酰胺和益生菌是否能更有效降低肠道炎症和氧化应激进而更好的保护肠道,现无明确定论。动物实验发现重度烧伤的大鼠模型肠道中一氧化氮(NO)明显增高,提示NO在烧伤引发肠道炎症和氧化应激中起重要作用。NO是重要的生理活性物质,其表达在正常情况下维持机体的生理机能。当NO异常增高会导致机体氧化应激和炎症反应的出现。由于谷氨酰胺、益生菌能抑制烧伤引发肠道炎症和氧化应激反应,而烧伤又能刺激肠道大量释放NO,故我们推测谷氨酰胺或益生菌的应用可能通过抑制肠道NO异常增高来发挥肠道保护作用,它们联合应用能够增强彼此抗氧化应激和抗炎症的能力,可能更有效发挥对肠道保护的功效。因此,我们拟通过大鼠重度烫伤模型研究谷氨酰胺和益生菌联合应用对肠道的保护作用以及了解联合应用是否通过降低肠道中NO来抑制肠道炎症和氧化应激,并深入阐明其相关机制。本研究发现严重烧伤能激活肠道大量合成NO,并引起肠道爆发氧化应激及炎症反应,导致肠道损伤。不仅如此我们还发现在烧伤后氧化应激反应是先于炎症反应,有效降低氧化应激反应就能减少机体及肠道炎症因子的释放。进一步研究还发现,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)通过NF-κB激活炎症反应,而抑制iNOS能有效降低机体及肠道的炎症反应。烧伤通过影响了iNOS基因高度甲基化状态导致iNOS异常表达,谷氨酰胺和益生菌联合应用能通过增强iNOS基因的甲基化水平而降低NO的合成及释放,最终抑制了烧伤引发的肠道氧化应激和炎症反应。因此,iNOS在烧伤引起的氧化应激和炎症反应中发挥了重要作用。谷氨酰胺和益生菌联合应用可通过调控iNOS基因的甲基化而抑制肠道氧化应激和炎症反应,进而保护肠道免于炎症引发的损伤。重度烧伤早期机体有大量体液渗出,且机体严重的应激反应使体内血流重分布,导致肠道血流量显著下降,引发肠道缺氧及营养和能量的缺乏,从而诱发氧化应激和炎症反应介导肠道损伤。肠道损伤后会发生肠上皮细胞的凋亡和坏死,导致肠黏膜通透性增强,肠道内的细菌和大分子物质容易通过肠壁进入血液,加重了氧化应激和炎症反应,进一步破坏肠道的机械屏障和免疫屏障,发展为全身性的感染。因此,严重烧伤的肠道保护在烧伤治疗中占据重要的地位。谷氨酰胺作为肠上皮细胞的主要能源物质在严重烧伤后会显著减少,研究发现严重烧伤后补充谷氨酰胺能够明显抑制肠道的炎症反应,维持肠道机械屏障,因而对烧伤后肠道具有强烈的保护作用。益生菌能调节肠道菌群,抑制有害菌的增殖,纠正肠道功能紊乱,同样对肠道的屏障功能具有明显的保护作用。谷氨酰胺和益生菌联合应用可能会更好的发挥对肠道的保护作用。如前所述,NO在重度烧伤动物模型的肠道中异常合成并大量释放,它可能是烧伤后肠道释放的重要应激分子及肠道损伤的主要因素。谷氨酰胺和益生菌联合应用可能通过抑制NO异常释放进而降低肠道损伤并保护肠道。NO是一种在胃肠道内广泛分布的生理活性物质,生理状态下其参与了胃肠道的运动及胃肠道粘膜的保护,而在烧伤、肠道炎症等情况下,NO则参与或加重肠道炎症反应。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸而生成。目前已知NOS有神经型NOS(n NOS)、内皮型NOS(e NOS)及诱导型NOS(iNOS),前两者称为结构型NOS(c NOS)。c NOS合成少量NO发挥生理效应,iNOS则可产生的过量NO而发挥有害效应。因此iNOS表达量是NO异常产生的关键。iNOS表达受到其DNA甲基化水平的调控,以往研究发现正常情况下机体中iNOS基因保持着高水平的甲基化状态并有效阻止iNOS的转录和表达。但在机体受到刺激或严重烧伤时iNOS的表达出现异常增高。iNOS基因的甲基化水平可能发生改变,从而影响iNOS的表达。由此我们推测,谷氨酰胺和益生菌保护肠道和抑制氧化应激的作用可能是通过调控iNOS基因的甲基化状态,从而抑制烧伤引发的肠道炎症反应及损伤。本研究发现烧伤能够刺激机体及肠道产生大量的NO、ROS、MDA并导致SOD活力降低,也能刺激机体及肠道释放炎症因子IL-6、TNF-α、IL-8,同时减少机体中IL-4的产生。通过联合应用谷氨酰胺和益生菌能够有效降低氧化应激标志物及炎症因子的释放,并对肠道屏障起保护作用。为明确NO是否在烧伤引发的肠道炎症中的作用和地位,我们采用NOS抑制剂L-NAME干预处理烫伤大鼠模型。实验发现大鼠烧伤后血液中TNF-α、IL-6增高时间比ROS、NO、MDA要晚,提示烧伤引发机体氧化应激早于炎症反应。L-NAME不仅有效抑制了肠道iNOS表达和NO合成,也能明显降低氧化应激指标(ROS、MDA)的水平和提高SOD活性以及减少炎症因子(TNF-α、前言IL-6)的产生,从而抑制了肠道的氧化应激和炎症反应。联合应用谷氨酰胺和益生菌与应用L-NAME抑制剂有类似效果,说明联合应用通过抑制NO合成降低了氧化应激及炎症反应,而iNOS是NO合成和释放的关键因素。而与以往研究不同的是,我们还证实了iNOS是通过对NF-κB的调控进而影响炎症反应。我们研究还发现谷氨酰胺和益生菌联合应用能够通过提高iNOS基因的甲基化水平来抑制iNOS的表达,从而减少NO的异常合成,同时其能提高PPARγ的表达,从而降低了肠道炎症和氧化损伤。总之,我们的研究不仅阐明了iNOS在烧伤引发肠道氧化应激和炎症反应中的重要作用,也初步探讨了谷氨酰胺和益生菌联合应用在有效抑制iNOS表达、减少烧伤引发的肠道炎症和损伤作用中的分子机制。研究目的1.明确严重烧伤所引起的机体及肠道氧化应激和炎症反应的相关机制及iNOS在其中发挥的作用;2.探讨谷氨酰胺和益生菌联合应用治疗烧伤引发的肠道损伤的药效和机制;3.阐明烧伤所诱发iNOS在肠道中高表达的原因及探讨谷氨酰胺和益生菌联合应用对iNOS表达的表观遗传学影响。材料和方法一、烧伤模型的建立、干预措施及取材1.雄性Wistar大鼠110只(8周龄,140g-185g),由第三军医大学实验动物中心提供。分组如下(根据实验设计分成两个大组):(1)对照组;模型组;谷氨酰胺治疗组;益生菌治疗组;谷氨酰胺+益生菌治疗组;(2)对照组;模型组;L-NAME(NOS抑制剂)组。致伤大鼠麻醉后将背部脱毛区浸以100℃沸水15s,制成20%体表面积全层皮肤烫伤模型。对照组则在大鼠麻醉后将背部脱毛区浸于25℃温水中15s。2.实验Ⅰ:对照组:1ml生理盐水灌胃;模型组:致伤后1ml生理盐水灌胃;谷氨酰胺治疗组:致伤后谷氨酰胺(1.5g/kg)+1ml生理盐水灌胃;益生菌治疗组:致伤后益生菌(300mg/kg)+1ml生理盐水灌胃;谷氨酰胺+益生菌治疗组:致伤后谷氨酰胺(1.5g/kg)+益生菌(300mg/kg)+1ml生理盐水灌胃。干预措施均为1次/d,连续7d。于伤后第7d,将各组大鼠麻醉并取肠管及血液样本。3.实验Ⅱ:对照组及模型组致伤后即尾静脉注射1ml生理盐水;L-NAME组致伤后即尾静脉注射L-NAME HCL(100mg/kg)。对照组、模型组和L-NAME组大鼠分别于伤后0、1、6,24h收集血液标本,于伤后24h麻醉后取肠组织样本。二、生化指标检测1.IL-6、IL-4、IL-8、TNF-α:酶联免疫吸附法和荧光检测法。2.ROS、SOD、MDA:化学发光法。3.NO:NO检测试剂盒。三、q RT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)检测以各组大鼠肠管提取总RNA,经反转录后,使用q RT-PCR技术检测各组样本的iNOS、e NOS、n NOS、NF-κB、Bax、EGF、IL-6、TNF-α、s ICAM-1、s VCAM-1、PPARγ、DNMT-1、Tet1及GADPH的m RNA表达水平。四、TUNNEL检测通过TUNNEL试剂盒检测肠道细胞凋亡情况,测100μm2凋亡细胞个数。五、HE检测对各组大鼠的肠道样本进行HE染色,观察各组大鼠肠道损伤情况。六、Western blot(WB)用SDS PAGE凝胶电泳分离转移各组别肠道蛋白并将蛋白转到PVDF膜上。脱脂奶粉封闭后分别孵以NF-κB、EGF、Bax、IKKB、PERK、ERK、P100、P52、DNMT-1、Tet1、iNOS、e NOS、n NOS、PPARγ和GAPDH抗体。在孵以辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗后以ECL法检测蛋白表达强度。七、甲基化特异性PCR检测(Methylation-Specific PCR,MS-PCR)DNA甲基化状态制备基因组DNA,DNA在亚硫酸氢盐处理后,采用DNA甲基化检测试剂盒用引物进行e NOS、iNOS甲基化DNA扩增。八、数据分析数据分析采用SPSS22.0软件。数据以平均值±标准差的形式表示。组间比较采用单因素方差分析,P0.05认为存在统计学差异。研究结果一、烧伤可诱发机体及肠道的氧化应激和炎症反应,谷氨酰胺和益生菌联合应用能够有效控制氧化应激和炎症反应的程度。采用化学发光法检测大鼠烫伤后血液中氧化应激的指标,发现NO、ROS、MDA在烧伤后处于增高状态,且SOD的活力受到严重抑制。ELISA检测发现血液中IL-6、TNF-α、IL-8均增高,而IL-4降低。谷氨酰胺和益生菌联合应用能够有效降低ROS、MDA、NO、TNF-a、IL-6、IL-8在血液中的含量、增高IL-4含量并显著提高SOD活力。肠组织的氧化应急指标及炎症因子的检测结果显示,除IL-4无明显变化外,其余指标的变化与血液中的变化趋势相同。实验结果说明烧伤诱发了机体及肠道的氧化应激和炎症反应,谷氨酰胺和益生菌联合应用可显著改善机体及肠道的氧化应激和炎症状态。二、烧伤后NO表达水平可影响机体及肠道的氧化应激和炎症反应,iNOS通过调控NF-κB而影响肠道炎症反应的程度。通过q RT-PCR、WB、ELISA和化学发光法检测L-NAME对烫伤大鼠氧化应激和炎症反应的影响,并明确NO在其中发挥的作用。研究发现伤后血液中SOD、MDA、ROS、NO的改变要早于IL-6、TNF-α,提示烧伤引发的氧化应激反应要先于炎症产生;伤后24h肠道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明显升高,SOD明显降低。L-NAME组肠道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明显降低,SOD明显升高。通过使用NOS抑制剂L-NAME抑制烧伤引发的NO异常合成,抑制了机体及肠道的氧化应激和炎症反应,证实了抑制NO可减少机体及肠道的氧化应激标志物和炎症因子的产生;L-NAME组iNOS表达明显降低,NF-κB P65表达随之降低,提示iNOS通过NF-κB而调控炎症反应。三、谷氨酰胺和益生菌联合应用对烧伤后肠道损伤的保护作用及相关机制。病理结果显示谷氨酰胺和益生菌联合应用能很好的修复肠道损伤,恢复肠道屏障功能。TUNNEL检测表明联合应用能明显减少肠道细胞的凋亡,WB及q RT-PCR检测发现联合应用抑制促凋亡相关蛋白BAX在肠道中的表达,而增高细胞修复相关的细胞因子EGF的表达,从而减少肠道损伤并激活肠道修复。WB及q RT-PCR检测发现,联合应用谷氨酰胺和益生菌可有效降低肠道中iNOS的表达,其通过抑制NF-κB经典途径而调控炎症和保护肠道。WB及q RT-PCR检测还发现联合应用谷氨酰胺和益生菌能够有效增强PPARγ表达,从而抑制NF-κB通路。故谷氨酰胺和益生菌联合应用对调控iNOS的表达及对肠道的保护具有重要的作用。四、谷氨酰胺和益生菌联合应用可通过调控iNOS基因的甲基化水平而调控iNOS表达。MS-PCR检测发现,iNOS基因的DNA甲基化水平烧伤后出现降低,联合应用谷氨酰胺和益生菌能够显著提高iNOS基因的甲基化水平,而e NOS基因的DNA甲基化水平在烧伤和联合应用后均没有明显改变。WB及q RT-PCR检测发现,烫伤后甲基化转移酶(DNMT-1)显著降低,去甲基化酶(Tet1)显著升高。谷氨酰胺和益生菌联合应用后,DNMT-1的表达水平提高,而Tet1的表达水平降低,实验结果表明谷氨酰胺和益生菌联合应用能够通过调控iNOS基因的甲基化水平而调控iNOS的表达。研究结论谷氨酰胺和益生菌联合应用能通过影响DNA甲基化酶及去甲基化酶的表达,提高iNOS基因的甲基化水平,从而使NO的表达显著降低,进而抑制了烧伤后肠道的氧化应激及炎症反应,减少肠道细胞凋亡,改善肠道修复功能并维护肠道的屏障功能。谷氨酰胺和益生菌联合应用能增强PPARγ的表达进而抑制NF-κB的表达,降低了肠道炎症反应,这可能是谷氨酰胺和益生菌联合应用有效保护肠道的重要机制。总之,本研究证实烧伤导致肠道iNOS的异常表达在烧伤引发的氧化应激和炎症反应中占据重要位置。谷氨酰胺和益生菌联合应用通过抑制烧伤后肠道iNOS的表达而发挥保护肠道的作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R644

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