七氟烷致学习记忆损伤及其影响突触传递功能的机制研究

发布时间：2018-03-19 08:34

本文选题：七氟烷　切入点：学习　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：全身麻醉药是否会对手术患者的学习记忆产生不利影响一直是学者关注的问题。在临床中工作中也确实发现有部分病人手术后会出现认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction, POCD),研究证实POCD的发生与麻醉用药或手术方式之间有一定的相关性,而不同的全身麻醉药或不同麻醉方法都有可能对学习记忆功能产生损伤作用。因此,研究麻醉药物对学习记忆的影响在临床工作中有着重要意义,值得深入研究。七氟烷是目前在临床上应用非常广泛的吸入全身麻醉药。已有研究报道七氟烷能导致患者手术后发生POCD;对中国人群而言,七氟烷是诱发非冠状动脉搭桥手术患者发生POCD的独立危险因素之一。有关吸入麻醉药七氟烷导致机体学习记忆功能减退的研究已越来越引起人们的重视,近年关于七氟烷对学习记忆影响的动物实验文献报道不少,但结果并无定论；多数实验结果认为七氟烷对幼年至老年动物均可造成记忆损伤；但在另一方面,也有不少文献报道七氟烷对动物学习记忆无明显损伤,甚至还有增强记忆的作用。本研究将从行为学,电生理学和分子生物学等多角度观察七氟烷致大鼠行为学改变与海马突触可塑性和相关蛋白表达的联系,探讨七氟烷致大鼠学习记忆损伤的可能机制,为临床精心选择麻醉药提供指导,以减少POCD的发生。第一部分七氟烷对大鼠学习记忆行为的影响目的：观察吸入不同浓度七氟烷对大鼠学习记忆的损伤作用。方法：SD雄性大鼠32只,随机分为对照组(Control组)、1.5%七氟烷组(Sevol组)、2.4%七氟烷组(Sevo2组)、3.0%七氟烷组(Sevo3组)4组,每组8只。Sevo各组大鼠置于麻醉箱中进行麻醉,七氟烷浓度分别稳定于1.5%(Sevol组)、2.4%(Sevo2组)或3.0%(Sevo3组),麻醉时间均为2h。各组在麻醉结束后24h分别进行Y型迷宫、水迷路测试和旷场实验,并测定相关行为学指标。结果：(1)各组大鼠Sp02和心率均在正常范围内,各组相比较差异无统计学意义(P0.05)。(2)Y型迷宫测试结果显示：吸入七氟烷后各组达标所需时间逐渐延长,训练次数增加；与Control组相比较,Sevol组、Sevo2组和Sevo3组的达标时间均显著延长(P0.01),而Sevo2组(P0.05)和Sevo3组(P0.01)的训练次数显著增加。(3)在水迷路测试中,随着吸入七氟烷浓度的增加,大鼠找到台阶的潜伏期时间明显延长,同时进入盲端的错误次数明显增加；其中Sevo2组和Sevo3组的潜伏期时间和错误次数与Control组相比较均显著增加(P0.01)。(4)旷场实验结果显示：随着吸入七氟烷浓度的增加,大鼠在中央区活动时间延长,站立次数下降；其中Sevo2组和Sevo3组的中央区活动时间与Control组相比较均显著增加(P0.01),而Sevo3组(P0.05)的大鼠站立次数与Control组相比较显著减少。结论：(1)吸入七氟烷2小时后对大鼠的学习记忆有损伤作用。(2)随着浓度的升高,七氟烷对大鼠学习记忆的损伤作用逐渐增加,在高浓度时损伤作用明显。第二部分七氟烷对离体大鼠海马脑片突触可塑性的影响目的：在离体海马脑片上采用细胞外电生理记录技术,观察七氟烷对大鼠海马CA1区突触可塑性的影响。方法：SD雄性大鼠断头取脑,制备离体海马脑片,在CA1区锥体细胞层记录电刺激诱发的群峰电位(Population spike, PS)。观察3%七氟烷对突触基础传递(PS)、双脉冲抑制(Paired pulse depression, PPD).. NMDA受体依赖型长时程抑制(NMDAR-LTD).代谢性谷氨酸受体依赖型长时程抑制(mGluR-LTD)以及分别使用NMDA受体谷氨酸位点拮抗剂2-氨基-5-磷酰基戊酸酯(D-2-amino-5-phosphonovaleric-acid, APV)和GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline methiodide, BMI)后的变化。结果：(1)七氟烷对突触基础传递的影响：Sevo组(P0.01)与Control组相比较,七氟烷使海马脑片PS幅值显著下降,Sevo组的输入-输出值(I/O)趋势整体向下移动；Sevo+BMI组(P0.01)和Sevo组相比较,PS幅值显著升高,Sevo+BMI组(P0.01)与BMI组相比较,PS幅值显著下降,BMI可部分减轻七氟烷对PS幅值的抑制作用。(2)七氟烷对PPD的影响：Sevo组(P0.01)与Control组相比较,七氟烷可以使海马脑片P2/P1比值显著增大。BMI 10μmol/L可部分减弱七氟烷对P2/P1比值增大作用。随着ACSF灌流液中Ca2+浓度的升高,P2/P1比值逐渐减小,对PPD有易化作用。在不同Ca2+浓度ACSF中,七氟烷使P2/P1比值明显增大,有减弱PPD的作用。(3)七氟烷对NMDAR-LTD的影响：NMDAR-LTD由低频刺激LFS(900个脉冲刺激,1Hz)诱导发生。Sevo组(P0.01)和Control组相比较,七氟烷可使LFS刺激后PS幅值显著下降；而在Sevo+APV组中,APV可完全阻断LFS对LTD的诱发作用。Ca2+螯合剂BAPTA0.5μmol/L明显抑制七氟烷对LTD的易化作用。(4)七氟烷对mGluR-LTD的影响：mGluR-LTD由mG1uR2/3激动剂LY354740诱发；七氟烷对LY354740引起的PS幅值降低无明显影响,Sevo+ LY354740组(P0.05)和LY354740组相比较,PS幅值无明显变化。结论：(1)七氟烷使海马脑片PS的幅值明显下降,同时输入-输出值(I/O)趋势整体向下移动,对Schaffer侧枝CA1锥体细胞的突触传递有抑制作用。(2)七氟烷使海马脑片PPD的P2/P1比值明显升高,抑制突触前传递,其作用与细胞外Ca2+浓度变化有关,GABA受体拮抗剂BMI不能完全取消其对PPD的抑制作用。(3)七氟烷易化海马NMDAR-LTD,降低海马突触传递效能,其作用与细胞内Ca2+浓度变化有关。(4)七氟烷对mGluR2/3-LTD无明显作用。第三部分七氟烷影响大鼠学习记忆功能的分子机制目的：采用分子生物学方法,探讨七氟烷损伤大鼠学习记忆时海马突触前相关蛋白表达的变化。方法：SD雄性大鼠32只,随机分为对照组(Control组)、1.5%七氟烷组(Sevol组)、2.4%七氟烷组(Sevo2组)、3.0%七氟烷组(Sevo3组)4组,每组8只。各组在麻醉结束后24h分别进行行为学测试,结束后即刻断头取脑,分离双侧海马取组织进行Western Blot检测,分析突触前相关蛋白Sytl和Syt4、mGluR2及BDNF/TrkB信号传导通路相关蛋白的变化。结果：(1)行为学结果见第一部分。(2)随着吸入七氟烷浓度的增加,Syrtl蛋白表达逐渐降低,Syt4蛋白表达逐渐升高；其中Sevo2组(P0.01)和Sevo3组(P0.01)的Sytl蛋白表达与Control组相比较显著减少；Sevol组(P0.05)、Sevo2组(P0.01)和Sevo3组(P0.01)的Syt4蛋白表达与Control组相比较显著增加。(2) Sevol组、Sevo2组和Sevo3组与Control组相比较,吸入七氟烷后mGluR2表达差异均无统计学意义(P0.05)。(3)随着吸入七氟烷浓度的增加,BDNF、 TrkB和p-TrkB表达均逐渐降低；其中Sevol组(P0.05)、Sevo2组(P0.01)和Sevo3组(P0.01)的BDNF表达与Control组相比较显著减少；Sevo2组(P0.01)和Sevo3组(P0.01)的TrkB和p-TrkB表达与Control组相比较显著减少。结论：(1)七氟烷对大鼠学习记忆能力的影响与减低Sytl表达和增加Syt4表达有关,2.4%和3%七氟烷作用明显。(2)七氟烷对mGluR2的表达无明显影响。(3)七氟烷对大鼠学习记忆能力的影响与抑制BDNF/TrκB信号传导通路有关,七氟烷减低BDNF、TrκB和p-TrκB表达,2.4%和3%七氟烷作用较明显。第四部分七氟烷识别突触结合蛋白1结合位点的模拟研究目的：采用现代生物信息学技术进行数据模拟,分析七氟烷在sytl结构域的具体结合位点。方法：(1)运用FTMap方法来预测Sytl结构域上的配体结合位点。(2)运用CORINA程序将七氟烷二维结构转换成三维构象。(3)使用UCSFDOCK6分子对接程序,将七氟烷三维分子与预测Sytl的配体结合位点相对接,获得“Sytl结构域-七氟烷复合物”。(4)运用AMBER11软件包中的AMBER10力场对“Sytl C结构域-七氟烷复合物”进行分子动态(MD)模拟实验。结果：Sytl C2A结构可能为七氟烷结合区域,这一区域有6个潜在的口袋与七氟烷对接,口袋2、3和6与七氟烷亲和力最强。其中口袋3最有可能,其亲和力测得值Kd(解离常数)= 12.6 μmol/L。对七氟烷与口袋3结合模式分析表明,口袋3中Leu185和Lys190号残基可以与七氟烷形成两个强氢键,Asp188残基可以与七氟烷形成一个较弱的卤键,这些化学键赋予了该复合物较高的稳定性。结论：七氟烷与Sytl C2A区域存在特异性结合位点,七氟烷可作用于这一特殊位点发挥药理学作用。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614

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