先天性巨细胞病毒中枢神经系统感染对学习记忆及突触可塑性相关信号通路的影响

发布时间：2018-03-20 08:18

本文选题：巨细胞病毒　切入点：中枢神经系统　出处：《华中科技大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分先天性巨细胞病毒中枢神经系统感染对小鼠学习记忆能力的影响 [目的]研究先天性巨细胞病毒中枢神经系统感染对小鼠学习记忆能力的影响。 [方法]①建立小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus, MCMV)中枢神经系统感染模型：用ELISA法筛选无感染史的SPF级BALB/c小鼠(H-2d),适应性饲养一周,按雌雄比例2：1合笼受孕,受孕母鼠单独饲养。仔鼠出生当天,随机分为实验组(7只)和对照组(7只),实验组在出生当日通过颅内注射接种MCMV Smith株病毒悬液(TCID50=10-5)1.75μl,对照组按相同方法接种病毒溶媒(含3%胎牛血清DMEM)1.75μl；②于30日龄应用物体识别实验检测两组小鼠对新物体探索时间和分辨指数；③在完成物体识别实验后3日,应用Morris水迷宫实验观察俩组小鼠游泳轨迹、游出距离和游泳潜伏期。 [结果]与对照组相比,①实验组新物体探索时间降低,分辨指数下降,差异均具有显著性(P0.05)；②与在训练后第3、4、5天逃生游泳轨迹长度明显增加,游出距离增加,游泳潜伏期延长,差异均具有显著性(P0.05)。 [结论]先天性MCMV中枢神经系统感染能导致小鼠学习记忆能力下降。第二部分先天性MCMV中枢神经系统感染对小鼠海马突触可塑性的影响 [目的]观察先天性MCMV中枢神经系统感染对小鼠海马突触可塑性的影响,探究MCMV感染导致认知能力下降的电生理机制。 [方法]①建立先天性MCMV中枢神经系统感染动物模型(同第一部分)。②制备小鼠海马脑片：取30日龄实验组和对照组小鼠各5只,乙醚麻醉后被迅速断头并快速取出其脑组织浸泡于通氧的预冷脑脊液中。用刀片切除部分无关的脑组织,暴露海马区,然后固定于切片机的载物台上。将502胶水均匀涂于切片机载物台上,并将脑组织牢固粘在载物台上。切取小鼠海马脑片,厚度400μm。将切好的脑片转移到孵育槽中孵育至少1.5小时,充分恢复脑片。③采用脑片膜片钳技术检测各组海马脑片海马场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)、长时程增强(long-term potentiation, LTP)、双脉冲易化(paired-pulse facilication, PPF)、海马CA1区锥体神经元微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory post synaptic currents, mEPSCs)累计电流及释放频率、海马CA1区NMDA受体及AMPA受体介导的兴奋性突触后电流(excitatory post synaptic currents, EPSCs)。 [结果]①与对照组(n=11,来源于5只小鼠)相比,给予HFS刺激后实验组(n=9,来源于5只小鼠)海马脑片CA3-CA1区典型的fEPSP降低,60分钟内LTP水平明显下降,差异极具显著性(P0.01)；②在给予HFS刺激之前,两组海马CA3-CA1区PPF反应过程在选取的4个点中差异均不具有显著性；在HFS刺激之前,在相同刺激强度下两组海马CA3-CA1区产生的fEPSP差异不具有显著性。③实验组(n=7,来源于5只小鼠)与对照组(n=6,来源于5只小鼠)相比,海马CA1区锥体神经元mEPSCs累计电流明显减少(P0.01),但其累积释放频率无明显差异(P0.05)。④实验组由NMDA受体途径介导的EPSCs电流振幅(27.6±2.3pA,n=7,来源于5只小鼠)显著低于对照组(53±4.8pA,n=11,来源于5只小鼠),差异极具显著性(P0.01)。⑤实验组由AMPA受体途径介导的EPSCs电流振幅(45.8±10pA,n=6)低于对照组(59.94-4.3pA,n=11,来源于5只小鼠),差异具有显著性(P0.05)。⑥实验组中由NMDA受体介导的EPSC振幅与AMPA介导的EPSC振幅比率(0.42±0.03,n=7,来源于5只小鼠)显著低于对照组(0.66±0.02,n=7,来源于5只小鼠),(P0.01)。 [结论]①MCMV先天性中枢神经系统感染能显著抑制海马CA3-CA1区信号传导通路的LTP,但不影响该区基础性突触传递。②CMV先天性中枢神经系统感染主要通过突触后机制影响CA3-CA1区信号传递,突触前递质释放功能无明显改变。③MCMV感染能显著降低海马CA1区NMDA受体和AMPA受体介导的EPSCs,其中对NMDA受体介导的EPSCs影响更加明显。总结：MCMV感染显著抑制海马神经元突触的LTP,其致病机理主要是通过损伤突触后机制的NMDA受体和AMPA受体途径的突触可塑性,对突触前机制的影响并不明显。第三部分先天性MCMV中枢神经系统感染对小鼠海马突触后机制相关蛋白合成与分泌的影响 [目的]研究先天性MCMV中枢神经系统感染对乳鼠海马突触后机制相关蛋白NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2合成及分泌的影响。 [方法]①建立先天性MCMV中枢神经系统感染模型(同第一部分),无菌收集完成Morris水迷宫实验后的小鼠脑组织,在解剖显微镜下分离出海马组织。②应用Real-time PCR及Western Blot技术检测各组海马突触后机制相关蛋白NR1、NR2A、 NR2B、GluR1、GluR2的编码基因转录水平及蛋白质表达水平。 [结果]与对照组(n=7)相比,实验组(n=7)海马NMDA受体亚基NR2A编码基因转录水平及蛋白质表达水平无明显改变；NMDA受体亚基NR1、AMPA受体亚基GluR1、GluR2编码基因转录水平及蛋白质表达水平均降低,差异具有显著性(P0.05); NMDA受体亚基NR2B编码基因转录水平及蛋白质表达水平显著降低(P0.01)。 [结论]先天性MCMV神经系统感染可降低小鼠海马NMDA受体亚基NR1、NR2B和AMPA受体亚基GluR1、GluR2编码基因转录水平及蛋白质表达水平。这可能是先天性MCMV神经系统感染导致学习记忆等认知功能障碍的发病机制。第四部分先天性MCMV中枢神经系统感染对小鼠海马胆固醇表达的影响 [目的]研究先天性MCMV中枢神经系统感染对小鼠海马胆固醇近期和中远期代谢水平的影响。 [方法]①建立先天性MCMV中枢神经系统感染模型(同第一部分),于3d、15d、30d快速活杀断头,无菌收集脑组织,在解剖显微镜下分离出海马(收集两组小鼠3d、15d、30d海马组织各7个)。②将海马组织放入匀浆器,按1ml/100mg加入色谱纯无水乙醇于冰上磨成匀浆；在15000r/min,4℃离心2次,每次20min。取上清液在0.45μm滤器中过滤2次,将滤液分装,-70℃保持,待测。③应用高效液相色谱技术(High-performance liquid chomatography,HPLC)检测各组海马胆固醇的表达水平。 [结果]①在选择的色谱条件下,胆固醇的保留时间为8.7min,胆固醇标准曲线线性关系良好,线性回归方程为：Y=4422624X+7835,R2=0.99969,最低检测限为0.03mg/ml。②仪器精密度实验变异系数为0.98%,仪器精密度良好；加样回收率实验证明平均回收率为99.12%。③对照组及实验组不同发育时期海马胆固醇表达水平：对照组3d,15d,30d海马胆固醇含量分别为：4.55±0.38mg/g,7.80±0.55mg/g,12.27±0.50mg/g；实验组其数值分别为：3.49±0.51mg/g,5.57±0.45mg/g,8.37±0.48mg/g。 [结论]①HPLC检测小鼠海马胆固醇具有最低检测限低、精密度高、回收率高、方便快捷等特点,我们的检测条件可为临床及基础研究者提供参考。②小鼠海马神经发育过程胆固醇表达水平渐进性升高,先天性MCMV中枢神经系统感染能在近期和中远期降低胆固醇表达水平。⑨CMV中枢神经系统感染干预海马胆固醇代谢,降低胆固醇表达水平,抑制神经元突触形成、发育及成熟可能是其导致学习记忆等认知功能障碍的另一个重要原因。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.251

【参考文献】