上转换纳米颗粒介导的光动力疗法修复脊髓损伤的实验研究

发布时间：2018-04-05 21:45

本文选题：脊髓损伤(SCI)　切入点：上转换纳米颗粒(UCNP)　出处：《天津医科大学》2014年博士论文

【摘要】：[目的]观察在体外共培养并且接受980nm近红外线照射后,上转换纳米颗粒(UCNPs-PEG-M540)对幼年Sprague Dawley (SD)大鼠脊髓星形胶质细胞的杀伤作用。探讨UCNPs介导的光动力疗法在促进大鼠脊髓损伤后减少损伤区胶质瘢痕的形成和行为功能恢复方面所起的作用。 [方法]采用溶剂热法合成具有核壳结构的上转换纳米颗粒(NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4,UCNPs),并用键联的方法在颗粒表面包裹聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)和部花青M540(Merocyanine540)。颗粒(NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4-PEG-M540, UCNPs-PEG-M540)在体外被波长980nm的近红外线激光照射后,用二苯基异苯并呋喃(Diphenylisobenzofuran, DPBF)检测是否有单线态氧(singlet oxygen,1O2)的产生。取实验用幼年SD鼠2只,麻醉后取出脊髓组织并剪碎,置入装有细胞培养液的培养瓶中培养,采用差速黏附和恒温摇床震摇法对细胞进行纯化。细胞在体外增殖,传代后,对其用GFAP免疫组化染色进行鉴定,并观察生长状况。传至第2代后,将星形胶质细胞收集并与颗粒共培养24小时,用波长980nm的近红外线激光照射后,MTT观察细胞存活情况。并用电镜观察细胞器结构的变化。与此同时,用NYU Impactor-II打击器制作Sprague Dawley大鼠胸10脊髓损伤模型(打击重量和高度为：10g×50mm)。将80只脊髓损伤大鼠随机分成4组：DMEM移植组；M540移植组：UCNPs-PEG移植组；UCNPs-PEG-M540移植组。大鼠脊髓损伤1周后,将上述4种移植物分别移植到4组大鼠脊髓损伤区周围。术后采用BBB评分对大鼠的行为功能恢复情况进行评价。12周后,从每组随机选取8只大鼠进行10%BDA顺行示踪标记。标记两周后处死动物,将损伤段脊髓取出作5μm快速冰冻切片后,进行BDA显影,GFAP和NF200免疫组化染色。BWestern blot定量分析GFAP在脊髓损伤区的表达。图片用image pro plus5.0和ImageJ软件处理,根据阳性反应的积分光密度值(IOD)进行组间比较。 [结果]透射电子显微镜(TEM)显示制备出的颗粒裸核NaYF4:Yb3+,Er3+基本呈六角状,且粒径比较均匀,通过粒度分析仪检测,结果显示颗粒直径在28nm左右。包壳后纳米颗粒的形状仍为六角状,纳米晶的平均尺寸为43nm。X-射线衍射(XRD)分析显示,包壳后纳米颗粒的衍射图谱与包壳前几乎一致。裸核及核壳结构纳米颗粒XRD图均与标准的六角相纳米颗粒NaYF4的衍射谱衍射峰的峰位吻合的很好,这说明本实验所制备出来的裸核颗粒及核壳结构纳米颗粒均是纯的六角相的纳米颗粒。傅立叶红外光谱证明在颗粒NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4的表面成功的包覆上了PEG。能量色散X射线光谱分析(Energy Dispersive X-Ray spectrometry, EDX)证明M540被成功的连接到颗粒表面。DPBF在410nm处的吸光度明显减低,说明经近红外线激发后,UCNPs-PEG-M540使周围的溶液中产生了单态氧。从幼鼠脊髓分离的星形胶质细胞,经纯化后可以在体外稳定的传4代以上,纯度为94.78%,形态类似成纤维细胞,GFAP染色呈阳性,细胞倍增时间约为2-3天。细胞与颗粒共培养,并经980nm近红外光照射后,MTT显示细胞存活率明显下降。电镜观察显示颗粒被细胞摄取,细胞膜皱缩,细胞核发生碎裂、溶解现象,线粒体溶解,核浆比例失调。细胞呈现凋亡或者坏死表现。将4种移植物分别移植到大鼠脊髓损伤区周围后4周开始,UCNPs-PEG-M540移植组动物的BBB评分显著高于其余3组(p0.05)。BDA顺行示踪标记显示UCNPs-PEG-M540移植组较其余三组有较多的再生神经纤维通过损伤区。在横断面上,UCNPs-PEG-M540移植组阳性反应区域的IOD值显著高于其余三组(p0.05)。NF200染色结果表明,UCNPs-PEG-M540移植组阳性反应面积的IOD值显著高于其余三组(p0.05)。而GFAP染色结果表明,UCNPs-PEG-M540移植组阳性反应面积的IOD值显著低于其余三组(p0.05)。(?)Vestern Blot结果显示,GFAP的灰度值在UCNP-PEG-M540移植组的脊髓损伤区周围最少(F值=2.17,P0.01),说明胶质瘢痕的形成在UCNP-PEG-M540移植组最少。 [结论]在980nm近红外光的激发下,上转换纳米颗粒UCNPs-PEG-M540可以有效的杀伤与其共培养的星形胶质细胞,可以有效的减少大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕的形成,并且促进轴突的再生和大鼠行为功能的恢复。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.2

【参考文献】