二烯丙基三硫和胱胺拮抗慢性正己烷中毒的效果及机制研究

发布时间：2018-04-05 23:02

  本文选题：正己烷　切入点：周围神经病变　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究目的正己烷(n-Hexane)是工业生产中一种常用的有机溶剂,主要用作粘合剂、油漆的生产原料,植物油的提取剂以及电子产业中的清洁剂。研究显示长期低浓度的正己烷暴露可导致职业中毒的发生,以感觉运动型周围神经损伤为主要临床特征。早期表现为肢体远端发麻、刺痛、蚁走感,手足发凉多汗、触觉减退,多成对称性分布,进一步发展可表现为肌力减退、下肢行走困难,严重了造成肌肉萎缩和瘫痪。1957年意大利报道了首例制鞋工人正己烷神经中毒的案例,随后日本、美国、加拿大、韩国、巴西等国家也相继出现了集体性正己烷职业病中毒的报道。中国从上世纪70-80年代开始发生正己烷中毒,随后逐年不断增加。正己烷导致神经病变的发生主要通过其代谢产物2,5-己二酮(2,5-HD)介导,但其分子机制至今尚不明确且无特效药物治疗。经对症治疗,一般需半年至一年才能恢复健康,部分严重中毒病例不能完全恢复。由于正己烷慢性中毒患者以中青年居多,不仅严重损害了患者本人的身心健康,同时也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此,开发安全有效正己烷中毒防治药物,既有利于其治疗,又可进一步阐明其中毒机制,具有非常重要的理论和现实意义。二烯丙基三硫(DATS)是大蒜的一种重要活性成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗动脉粥样硬化等多重功效,还能够对多种P450酶起到调节作用。实验室之前的研究表明大蒜油对正己烷中毒具有保护作用,其机制与影响正己烷代谢和抵抗氧化应激有关,而大蒜油中DATS的含量占到50%以上,因此DATS有可能是大蒜油发挥拮抗正己烷毒性的活性成分。综合DATS多重功效及其对代谢的调节作用,我们认为其可能是大蒜油拮抗正己烷中毒的活性成分。胱胺是一种具有神经保护作用的氨基二硫化物,对帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)等多种神经退行性疾病具有很好的预防和治疗作用。胱胺不但能够促进神经营养因子的分泌,而且具有抗氧化、抑制神经细胞凋亡、抵抗神经系统的炎症反应等多重功效但是至今为止尚没有关于胱胺预防和治疗外源化学物引起的周围神经病变的报道。因此,本研究为了探讨DATS和胱胺对正己烷神经损伤的保护作用,分别通过正己烷和2,5-HD经口灌胃染毒建立正己烷周围神经损伤模型,给予DATS和胱胺干预,通过相关行为学指标评价其干预效果;并进一步分别从代谢和分子生物学角度对DATS和胱胺发挥作用的机制进行了探讨。最后,通过DATS和胱胺的联合给药,评价其共同拮抗正己烷中毒性周围神经病的效果。研究方法1.DATS对慢性正己烷神经损伤的保护作用Wistar大鼠72只,随机分为6组,即对照组、模型组、DATS对照组、低中高剂量DATS干预组。DATS对照组(30 mg/kg)和低中高剂量DATS组(10,20,30 mg/kg)动物每天经口给予DATS,其余动物给予等体积玉米油;2 h后,除对照组和DATS对照组外,其余动物经口给予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天,连续染毒8周至模型组动物出现明显瘫痪症状。每两周测定一次四肢抓力,最后进行步态评分对DATS的干预效果进行评价。在染毒结束前一周,从模型组和DATS干预组中每组随机选取6只大鼠,于正己烷暴露后每2h经颈静脉取血分离血清,连续10次,每次0.4ml。通过气相色谱法和埃利希反应测定血清中的游离2,5-HD和吡咯加合物水平,采用DAS3.0对其毒代动力学参数进行分析。动物处死后,取肝、肾、脑、脊髓和坐骨神经测定其中吡咯加合物的水平。取肝脏组织,利用RIPA裂解液匀浆后,离心取上清Western Blot检测肝脏中正己烷代谢相关的CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的蛋白含量。肝脏经TMS缓冲液匀浆后超速离心制备微粒体,测定CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1 和 CYP2E1 的活性。2.胱胺对慢性正己烷神经损伤的保护作用Wistar大鼠50只,随机分为5组,即对照组、模型组、胱胺对照组、低高剂量胱胺干预组。胱胺对照组(60 mg/kg)、低高剂量胱胺组(30 mg/kg、60 mg/kg)动物经腹腔注射给予胱胺,其余动物给予等体积生理盐水;2h后,除对照组和胱胺对照组外,其余动物经口给予2,5-HD(300 mg/kg)。每周染毒6天,连续染毒6周至模型组动物出现明显瘫痪症状。每周采用步态评分和加速转棒试验对胱胺的干预效果进行评价。病理学检查:大鼠经麻醉后心脏灌注固定,制备坐骨神经石蜡切片,行固蓝染色观察病理改变。分别采用Elisa法检测血清中BDNF的含量,实时荧光定量PCR检测脊髓中BDNFmRNA 的含量,Western blot 检测脊髓中 BDNF、PI3K/Akt、Hsp-70 蛋白的表达。3.DATS和胱胺联合作用对正己烷神经损伤的保护效果Wistar大鼠40只,随机分为4组,即正己烷模型组、胱胺干预组、DATS干预组、DATS胱胺联合干预组。胱胺干预组、DATS胱胺联合干预组动物经腹腔注射给予胱胺(60mg/kg);DATS干预组、DATS胱胺联合干预组经口灌胃给予DATS(30 mg/kg);其余动物给予等体积溶剂。2 h后,各组动物均经口给予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天,连续染毒8周至模型组动物出现明显瘫痪症状,每两周进行一次加速转棒试验和鼠尾电生理测试评价DATS和胱胺联合作用对正己烷神经损伤的保护效果。研究结果1.DATS对慢性正己烷神经损伤的保护作用1.1 DATS对正己烷染毒大鼠行为学的影响四肢抓力:与对照组相比,正己烷染毒大鼠自6周起开始出现明显下降。染毒结束时,与模型组相比低、中、高剂量DATS干预使得大鼠四肢抓力分别提升了 7.9%,41.6%和 63.1%(P0.05);步态评分:染毒结束时,模型组大鼠步态出现明显异常,步态评分升至3.25±0.87;10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS 干预组步态评分改善为 3.17±0.83,2.33± 1.07(P0.05),1.67±0.49(P0.01)。1.2 DATS对正己烷染毒大鼠血清中2,5-HD和吡咯加合物毒代动力学的影响与模型组大鼠相比,10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预组2,5-HD曲线下面积(AUC0-t)分别下降了 3.3%,17.1%和37.4%(P0.05),而吡咯加合物曲线下面积下降了 6.9%,7.0%和26.5%(P0.05);血清中2,5-HD的最大浓度(Cmax)下降了 11.7%,17.4%和30.3%,而吡咯加合物最大浓度(Cmax)下降了9.4%,9.4%和 25.8%(P0.05)。1.3 DATS对正己烷染毒大鼠组织中吡咯加合物蓄积的影响与模型组相比,DATS干预使得各组织脏器中蓄积的吡咯加合物出现了不同程度的下降:10 mg/kg、20 mg/kg、3 0 mg/kg DATS干预组大鼠肝脏中吡咯加合物下降了 2.0%,5.6%和16.1%;肾脏中吡咯加合物下降了 8.0%,21.6%和29.2%;大脑中吡咯加合物下降了 9.9%,21.3%和22.3%;脊髓中吡咯加合物下降了19.7%,24.4%和41.5%;坐骨神经中吡咯加合物下降了 10.0%,15.3%和27.1%。20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预组大鼠肾脏、大脑、脊髓和坐骨神经中吡咯加合物的下降均较模型组具有统计学差异(P0.05或P0.01)。1.4 DATS对正己烷染毒大鼠肝脏中相关代谢酶含量的影响与模型组相比,DATS干预使得CYP1A1的表达增加,CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的表达降低。10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预使肝脏中CYP1A1 分别增加了 0.3%、9.2%和 54.2%(P0.05);CYP1A2 降低了 12.8%、24.5%和 23.2%;CYP2B1/2 降低了-6.9%、15.1%和 27.4%(P0.01);CYP2E1降低了 27.9%(P0.05)、32.1%(P0.05)和 43.5%(P0.01)。1.5 DATS对正己烷染毒大鼠肝脏中相关代谢酶活性的影响与模型组相比,DATS干预使得CYP1A1活性增强,CYP2B1和CYP2E1的活性减弱。其中20 mg/kg和30 mg/kg DATS干预使肝脏中CYP1A1活性增加了23.4%(P0.05)和29.5%(P0.01),差异具有统计学意义;30mg/kg DATS干预使得 CYP2B1 活性降低了 23.1%(P0.01);10 mg/kg、20 mg/kg 和 30 mg/kg DATS干预使得CYP2E1分别降低了 25.6%、30.4%和39.9%,差异均具有显著性(P0.05 或P0.01)。2.胱胺对慢性正己烷神经损伤的保护作用2.1胱胺对2,5-HD染毒大鼠行为学的影响步态评分:60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干预组分别自第二周和第三周开始与模型组表现出统计学差异(P0.05)。染毒结束时,模型组7/10的大鼠完全瘫痪,30 mg/kg干预组1/10的大鼠完全瘫痪,60 mg/kg干预组未有完全瘫痪的大鼠;30 mg/kg和60 mg/kg干预组大鼠的步态评分结果较模型组分别下降了 24.3%(P0.01)和 37.8%(P0.01)。加速转棒试验:与模型组相比,60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干预组分别自第3周和第5周开始与2,5-HD模型组表现出统计学差异(P0.05)。染毒结束时,模型组大鼠基本上不能在转棒上停留,30 mg/kg和60 mg/kg干预组大鼠的潜伏期分别较模型组提升了 216.8%(P0.05)和325.7%(P0.01)。2.2血清和脊髓组织中BDNF蛋白含量以及脊髓组织中BDNF mRNA含量的改变与对照组相比,模型组血清中BDNF的含量降低了 31.4%(P0.01),脊髓中mature-BDNF的含量下降了 37.6%(P0.01),脊髓中BDNF mRNA的含量降低了 52.1%(P0.05)。与模型组相比,30 mg/kg和60mg/kg胱胺干预组血清中BDNF的含量分别提高了 18.1%(P0.05)和38.9%(P0.01),脊髓组织中precursor-BDNF 的含量较模型组提高了 8.2%和 29.3%(P0.01),mature-BDNF提高了 107.2%(P0.01)和 300.5%(P0.01),脊髓组织中 BDNF mRNA 含量约为模型组的2,1倍和2.7倍。2.3脊髓组织中PI3K/Akt信号通路及Hsp-70蛋白含量的改变与模型组相比,30mg/kg、60mg/kg胱胺干预使得脊髓中p-PI3K/PI3K比率提升了 110.6%和179.6%,p-Akt/Akt比率提升了 112.7%,均具有统计学差异(P0.01);脊髓中Hsp-70的表达分别提高了 21.1%和39.7(P0.05)。3.DATS和胱胺联合作用对正己烷神经损伤的保护效果加速转棒试验:胱胺干预组、DATS胱胺联合干预组自第4周开始与模型组存在统计学差异;DATS干预组自第6周开始与模型组存在统计学差异;DATS胱胺联合干预组分别自第4周、第6周与DATS干预组、胱胺干预组存在统计学差异。至染毒结束时,DATS干预组、胱胺干预组和DATS胱胺联合干预组潜伏期分别提升至模型组的2.7倍、3.3倍和5.2倍;DATS胱胺联合干预组潜伏期较DATS干预组组提高了 95.2%,较胱胺干预组提高了 60.0%。鼠尾电生理:DATS干预组、胱胺干预组和DATS胱胺联合干预组分别自第6周、第6周和第4周开始与模型组出现统计学差异;DATS胱胺联合干预组自第4周与DATS干预组、胱胺干预组出现统计学差异。染毒结束时DATS干预组、胱胺干预组和DATS胱胺联合干预组NCV分别较模型组提升了 19.8%、23.5%和51.3%;DATS胱胺联合干预组潜伏期较DATS干预组组提高了 26.3%,较胱胺干预组提高了 22.5%。结论1.DATS可有效拮抗慢性正己烷中毒所致的周围神经损伤,可能与其抑制正己烷代谢活化,促进其代谢解毒,降低2,5-HD的量有关。2.胱胺可以拮抗大鼠正己烷中毒模型的神经损伤,其机制可能是与抑制2,5-HD引起的BDNF含量下降、激活PI3K/Akt信号通路以及上调Hsp-70的表达有关。3.DATS和胱胺联合作用可以更有效的拮抗正己烷所致的周围神经损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R135.1
，

本文编号：1716847