缺氧诱导因子-1α相关分子影响动脉粥样硬化斑块形成及稳定牲的机制研究

发布时间：2018-04-18 05:29

  本文选题：动脉粥样硬化 + 斑块形成　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作为慢性炎症性病理基础,主要涉及大中动脉并可导致冠心病、缺血性坏死、腹主动脉瘤、心力衰竭以及脑卒中等多种心脑血管疾病,是导致世界范围内高致死率和高致残率的主要危险因素。作为一个复杂的病理过程,AS的进程涉及多种血管成分、代谢以及免疫炎症反应。近年来,人们已对AS的发生机制进行了探究,然而导致AS的具体发病机制目前尚不十分明确,因此探究导致AS的危险因素并探讨其致AS的病理机制已成为当今心血管领域的研究热点之一,并可为AS的预防提供有效干预靶点。脯氨酸羟化酶(Prolyl Hydroxylase domain enzymes, PHDs)属于亚铁离子和2-酮戊二酸依赖性羟化酶家族,目前在人类基因组中,发现了3个PHDs成员,分别命名为PHD1-PHD3。其中,PHD3在这3种酶中活性最高。因此,PHD2一直是PHDs家族的研究热点。PHD3的主要作用是调节缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible Factor,HIF)的水平和活性。HIF是一种在多种生理状态调节中起关键作用的转录因子,它通过调节多种应激蛋白的基因表达,调控如氧化应激、血管新生和细胞凋亡等病理生理过程。而细胞内感受器PHD3是调节HIF-1平衡和活性的重要分子,在常氧状态下,它可以将HIF-1α在402及564位的脯氨酸位点羟基化,促进HIF-1α的降解,达到调节细胞内稳态的作用。PHD3主要受两种途径调控。第一个途径是缺氧/HIF依赖性途径。在缺氧状态下,HIF-1α羟基化和泛素化减少,胞浆中HIF-1α含量上升,增多的HIF-1α能直接结合到PHD3的启动子上,在转录水平上促进其表达升高。第二个途径是非缺氧相关途径。如在小鼠肾小管球旁细胞中,用血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)刺激细胞,会引起PHD3在mRNA和蛋白水平上表达升高。有研究发现,在微血管栓塞敲除PHD3基因可以减少红细胞和血小板聚集、减少血管痉挛,从而缓解症状。心肌梗死和缺血再灌注等动物模型中,敲除PHD3基因可以减少红抑制细胞凋亡和心脏重构,从而改善心功能。与新生儿肺血管平滑肌细胞相比,PHD3在成人肺血管平滑肌细胞中表达增高,且PHD3的表达上升与肺血管平滑肌细胞的凋亡、迁移和分泌等功能相关。在大鼠主动脉球囊拉伤的模型中,PHD3在新生血管中表达升高,提示PHD3可能参与血管新生的过程。PHD3还参与调控多种炎症细胞的增殖、分化和凋亡,从而调控全身及局部的炎症反应。PHD3在巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等多种炎症细胞中表达。在中性粒细胞的相关研究中,PHD3能够调控炎症细胞的粘附、趋化和分泌等功能,从而调控全身及局部的炎症反应。另有研究发现,PHD3在具有促炎功能的巨噬细胞(M1)中高表达,在AS发生发展过程中M1和M2亚型巨噬细胞可同时存在于粥样斑块内,在炎症早期,多种炎性介质能够诱导M1型巨噬细胞比例升高,M1型巨噬细胞促进多种促炎因子如肿瘤坏死因子α (TNF-α),白介素(interleukin, IL) 6和单核细胞趋化蛋白(Monocyte chemoattractant protein, MCP) 1等的生成,促进炎症的进展。但随着炎症进一步发展,M2型巨噬细胞逐渐增多,可延缓或抑制炎症反应,促进损伤修复。前述已有研究证明,PHD3在M1型巨噬细胞中表达,且在炎症局部,M1细胞中PHD3表达量增多,且PHD3可能促进M1细胞迁移和坏死,促进多种炎症介质的释放。综上所述,PHD3在主动脉内皮、血管平滑肌细胞和巨噬细胞等多种细胞中均有表达。在缺血缺氧、损伤和炎症等刺激下,细胞内的PHD3能够接受刺激因素的变化,发挥其羟化酶的活性,影响其底物蛋白的功能。研究表明,在病理状态下,PHD3可以调节血管平滑肌细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等多种细胞的功能,并促进多种炎症介质和金属基质蛋白酶的分泌,影响细胞外基质的稳定。由此可见,我们推测PHD3很有可能参与了动脉粥样硬化斑块的发生及稳定性的调节。但到目前,PHD3在动脉粥样硬化斑块形成过程中发挥的作用及对斑块稳定性的影响,国内外尚未见相关报道,因此这一问题亟待探讨和解决。研究目的：1.通过对ApoE-/-小鼠转染携带PHD3的慢病毒,探究PHD3对AS斑块形成的影响；2.探究PHD3对AS斑块内脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原的影响；3.通过体内外实验探究PHD3对内皮细胞的影响及其相关信号通路；研究方法：1.构建动脉粥样硬化动物模型将100只6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为5组(每组20只),分别为普通饮食组(control组)、高脂组(HFD组)、PHD3高表达慢病毒干预组(lv-PHD3组)、PHD3-shRNA干预组(Sh-PHD3组)和慢病毒空载体干预组(NC组)。适应性喂养1周后,对lv-PHD3组、sh-PHD3组和NC组小鼠分别注射PHD3-lentivirus慢病毒、PHD3-shRNA慢病毒和空载体慢病毒(2×107TU/只)。转染2周后取材,制备冰冻切片,检测病毒转染效率。喂养12周后,小鼠预先禁食12小时后称重,用0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉,心脏取血,离心后取上清保存于-80度冰箱。用生理盐水冲洗小鼠的心脏和主动脉,防止血液残留。部分小鼠继以4%多聚甲醛进行内固定。剥离小鼠心脏和主动脉,部分放入4%多聚甲醛固定,其余动物标本保存于-80度冰箱。2.主动脉表面AS病变染色将浸泡于4%多聚甲醛中的组织取出,从主动脉弓到腹主动脉分叉处剥离周围结缔组织成分,延主动脉小弯一侧剖开组织并展开固定于蜡板上,用油红O染液染色30分钟,红色区域为被染色的AS斑块。AS的病变严重程度用斑块占整个主动脉表面积的百分比表示。3.主动脉根部AS病灶分析以6μm的厚度连续切小鼠主动脉根部,做平行于瓣环的冰冻切片,后对斑块内结构和成分进行染色,如苏木素-伊红染色和油红O染色,以此分析主动脉根部的形态及检测主动脉根部的斑块面积。病变的严重程度用总斑块面积占整个瓣环面积的比例表示。4.组织学染色选取冰冻切片行PHD3、ICAM-1、VCAM-1、MOMA-2、α-SMA免疫组织化学染色,明确PHD3表达对炎症因子ICAM-1、VCAM-1以及斑块内巨噬细胞和平滑肌细胞的影响；应用天狼猩红染色和Masson染色,明确PHD3表达对斑块内胶原纤维的影响。5. TUNEL染色用冰冻切片行TUNEL染色,检测小鼠斑块内的凋亡情况,以及对人脐静脉内皮细胞进行TUNEL染色,检测PHD3对内皮细胞凋亡的影响。6.Western blot分析称取小鼠主动脉组织,或收集细胞,提取蛋白,以β-actin为内参,检测PHD3、 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平；同时检测内皮细胞中ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平。7.统计学分析所有结果均以均数±标准差的形式表示。多组之间比较应用单因素方差分析(ANOVA),两组之间比较应用Student t检验。P0.05被认为存在统计学差异。应用SPSS 18.0软件分析处理数据。所有数据均重复三次。研究结果：1.各组小鼠的一般情况在处死动物前,对高脂组、lv-PHD3组、sh-PHD3组及NC组中小鼠的体重、血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平进行检测,结果显示以上指标在各组中并不存在浓度差异(P0.05)。这表明PHD3病毒转染并不影响小鼠体内整体的脂质代谢。2.慢病毒转染后PHD3在动脉粥样硬化斑块中的表达免疫组化结果显示,与control组对比,HFD组斑块中PHD3表达升高(P0.05)。与NC组对比,PHD3 lentivirus转染组小鼠斑块中PHD3表达显著增高,而PHD3-shRNA慢病毒转染组小鼠斑块中PHD3显著减少(P均0.05)。Western blot结果与免疫组化结果一致。这一结果表明,PHD3病毒可有效干预小鼠主动脉根部斑块中PHD3的表达。3.PHD3慢病毒转染后对主动脉斑块内脂质聚集的影响小鼠主动脉大体油红O染色显示,HFD组较control组斑块面积显著增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组斑块面积显著增加(P0.05),而sh-PHD3组斑块面积明显减少(P0.05)。主动脉根部横切面油红O染色结果与大体油红O染色结果一致。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内脂质的积聚,而抑制PHD3后斑块内脂质积聚减少。4.PHD3慢病毒转染后对小鼠主动脉根部斑块及内皮细胞凋亡的影响小鼠主动脉根部横切面TUNEL染色结果显示,HFD组中细胞凋亡较control组明显增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组凋亡程度显著增加(P0.05),而sh-PHD3组凋亡程度明显减轻(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内细胞的凋亡,而抑制PHD3可显著抑制斑块内的凋亡情况。内皮细胞的TUNEL染色结果显示,与NC组比较,lv-PHD3组中内皮细胞凋亡数量明显(P0.05),而SiPHD3组中内皮细胞凋亡明显减少,表明PHD3的表达水平与内皮细胞的凋亡存在密切关系。5.PHD3慢病毒转染后对小鼠主动脉根部斑块内巨噬细胞的影响小鼠主动脉根部横切面MOMA-2免疫组化结果显示,HFD组中巨噬细胞数量较control组明显增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组中巨噬细胞数量显著增加(P0.05),而sh-PHD3组巨噬细胞数量明显减轻(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内巨噬细胞的数量,而抑制PHD3可显著抑制斑块内的巨噬细胞数量。6.PHD3慢病毒转染后对小鼠主动脉根部斑块内平滑肌细胞的影响小鼠主动脉根部横切面α-SMA免疫组化结果显示,HFD组斑块中平滑肌细胞数量较control组明显增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组斑块中平滑肌细胞数量显著增加(P0.05),而sh-PHD3组斑块中平滑肌细胞数量明显减少(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内平滑肌细胞的迁移,而抑制PHD3可显著抑制斑块内的平滑肌细胞的迁移。7.PHD3慢病毒转染后对小鼠主动脉根部斑块内胶原纤维的影响小鼠主动脉根部横切面的天狼猩红染色和Masson染色结果显示,HFD组斑块中胶原纤维含量较control组明显增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组斑块中胶原纤维含量显著增加(P0.05),而sh-PHD3组斑块中胶原纤维含量明显减少(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内胶原纤维含量,而抑制PHD3可显著抑制斑块内的胶原纤维生成。8.PHD3慢病毒转染后对ICAM-1的影响小鼠主动脉根部横切面ICAM-1免疫组化结果显示,HFD组斑块中ICAM-1较control组明显增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组斑块中ICAM-1含量显著增加(P0.05),而sh-PHD3组斑块中ICAM-1含量明显减少(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内ICAM-1的表达,而抑制PHD3可显著抑制斑块内ICAM-1的表达。9.PHD3慢病毒转染后对VCAM-1的影响小鼠主动脉根部横切面VCAM-1免疫组化结果显示,HFD组斑块中VCAM-1较control组明显增加(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组斑块中VCAM-1含量显著增加(P0.05),而sh-PHD3组斑块中VCAM-1含量明显减少(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉根部斑块内VCAM-1的表达,而抑制PHD3可显著抑制斑块内VCAM-1的表达。10.PHD3慢病毒转染后对炎性因子的影响Western Blot结果显示,HFD组中MCP-1、TNF-α和IL-1 β的表达水平较control组升高(P0.05)；与NC组比较,lv-PHD3组主动脉中MCP-1、TNF-α和IL-1β的表达量显著增加(P0.05),而sh-PHD3组主动脉中MCP-1、TNF-α和IL-1 β表达量明显减少(P0.05)。以上结果表明,PHD3过表达可增加小鼠主动脉内炎症因子的表达,而抑制PHD3可显著抑制炎症因子的生成。结论：1.PHD3过表达慢病毒转染可加速AS斑块的形成,而抑制PHD3则可减少斑块的形成；2.PHD3通过增加动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞浸润和平滑肌细胞迁移促进动脉粥样硬化的形成；3.PHD3过表达慢病毒转染可促进AS斑块内VCAM-1和ICAM-1的表达；4. MAPK信号通路介导了PHD3对内皮细胞的影响。背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作为慢性炎症性病理基础,是导致世界范围内高致死率和高致残率的重要危险因素。作为一个复杂的病理过程,AS进程涉及多种血管成分、代谢以及免疫炎症反应等。AS斑块的破裂可引起一系列急性心血管事件,如急性冠脉综合征,严重者可危及生命。近年来,人们已对影响AS的发生及斑块稳定性的机制进行了探究,然而影响AS斑块稳定性的具体发病机制目前尚不明确。因此积极寻找导致AS斑块破裂的靶点,并探寻有效的干预机制,将为控制AS斑块破裂提供有效预防措施,从而降低急性心血管事件的死亡率。内脏脂肪素(visfatin)也被称为前B细胞集落增强因子(PBEF)和磷酸核糖转移酶(Nampt)。visfatin是一种脂肪细胞因子,表现出促炎、胰岛素样作用,并与血脂代谢、胰岛素抵抗和胰腺B细胞功能等密切相关。细胞内,visfatin作为Nampt,其主要作用是调节细胞内NAD代谢,参与细胞的代谢、生存、凋亡等活动。细胞外,visfatin可通过促进炎症因子的释放而促进炎症反应的发生。Visfatin可调节许多促炎因子和抗炎因子的表达包括IL-6、IL-1β和TNF-α等,其中对IL-6的影响最为明显。visfatin还可促进TGF-β1的释放,进而影响细胞的生长、分化和凋亡。在HUVECs中,visfatin可促进MMP-2和MMP-9的表达,并可通过激活ERK1/2以及PI3K/AKT信号通路增加血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)的生成。visfatin还可通过激活NF-κB通路促进HUVECs释放ICAM-1和VCAM-1。除上述visfatin对炎症因子表达的影响外,多个研究还证实了visfatin与多种炎症性疾病密切相关。在Crohn病和溃疡性结肠炎患者血清中visfatin水平较健康人群升高,且在mRNA水平升高更为明显。在骨关节炎中,visfatin可促进释放过量前列腺素2。此外,visfatin还参与了风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的发病,RA患者滑膜成纤维细胞中visfatin水平受toll样受体配体调节。既往研究表明,visfatin与AS之间存在紧密联系。在代谢综合征或颈动脉粥样硬化患者中,血清visfatin水平明显升高。AS患者颈动脉斑块内visfatin的基因表达增多,且斑块内visfatin聚集的部位存在大量富含脂质的巨噬细胞。急性心肌梗死患者血清visfatin水平明显升高,且Ox-LDL和TNF-α均可诱导患者单核细胞中visfatin的表达增加。在男性急性ST段抬高心肌梗死患者中,visfatin被发现在中性粒细胞中表达升高,且visfatin活性也大大增加。在冠状动脉破裂斑块及巨噬细胞中,visfatin的表达明显上调。此外,在人内皮细胞中,visfatin还可在mRNA水平促进MCP-1和CCR2的表达,从而招募巨噬细胞到炎症部位。Visfatin还可上调CD36和SRA的表达并下调ABCA1和ABCG1的表达,从而促进了ox-LDL的摄取及减少胆固醇的外流,通过PI3K及ERK依赖性途径促进了泡沫细胞的形成。在THP-1细胞中,visfatin可剂量依赖性的增加EMMPRIN和MMP-9的生成,这一促炎效应是通过NAMPT-MAPK (p38, ERK1/2)-NF-κB信号通路实现的,而MMP-9表达增加可进一步降解胶原纤维,使胶原含量减少。综上所述,visfatin参与了多种炎症性疾病的进展,并促进了AS的发生过程。在急性心肌梗死患者中血清visfatin水平升高,提示visfatin或许与AS斑块的破裂密切相关,但其对AS易损斑块的作用机制尚不完全明确。因此,仍存在以下问题亟待解决：(1) visfatin对AS斑块稳定性的具体影响；(2) visfatin对AS斑块内成分的影响；(3) visfatin发挥作用的信号机制。研究目标1.通过visfatin慢病毒转染,明确visfatin高表达对AS斑块稳定性的影响2.探讨visfatin慢病毒转染对AS斑块内巨噬细胞、脂质积聚、平渭肌细胞以及胶原纤维的影响；3.探讨visfatin促进AS斑块中MMP-8表达的相关信号通路。研究方法1.构建动物模型80只6周龄雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养2周后,对小鼠行颈动脉套管,套管位置在左颈总动脉处。继续高脂喂养8周后,随机将小鼠分为2组(每组40只),分别为lenti-visfatin组和lenti-null组。Lenti-visfatin组给予1×107 TUvisfatin高表达慢病毒局部浸润,lenti-null组给予1×107TU空载体病毒局部浸润。继续喂养4周后,小鼠预先禁食12小时后称重,用0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉,心脏取血,离心后取上清保存于-80度冰箱。用生理盐水冲洗小鼠的心脏和主动脉,防止血液残留。部分小鼠继以4%多聚甲醛进行内固定。剥离小鼠颈动脉,部分放入4%多聚甲醛固定,其余动物标本保存于-80度冰箱。2.血清学检测检测小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。3.颈动脉油红O染色以6μm的厚度连续切小鼠颈动脉,并进行油红O染色,以此分析颈动脉处斑块内脂质的聚集。病变的严重程度用油红O阳性染色区域面积占整个颈动脉面积的比例表示。4.组织学染色选取冰冻切片行visfatin、MOMA-2、α-SMA、MMP-8免疫组织化学染色,明确visfatin高表达对斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞及MMP-8的影响；应用天狼猩红染色,明确visfatin高表达对斑块内胶原纤维的影响。5.Western blot分析称取小鼠颈动脉组织,或收集细胞,提取蛋白,以β-actin为内参,检测visfatin、 MMP-1、MMP-2、MMP-8和MMP-9的蛋白表达水平；同时检测RAW264.7细胞中P65和I κ B α的磷酸化水平。6.实时定量PCR (real-time PCR)检测应用Trizol法提取小鼠颈动脉和RAW264.7细胞总RNA,以β-actin为内参,检测visfatin和MMP-8的mRNA表达水平。7.免疫荧光染色取小鼠颈动脉冰冻切片进行visfatin、巨噬细胞及MMP-8的免疫荧光染色,检测visfatin在小鼠主动脉斑块内的表达及定位情况。Visfatin刺激RAW264.7细胞,免疫荧光检测MMP-8的表达。8.统计学分析所有结果均以均数±标准差的形式表示。多组之间比较应用单因素方差分析(ANOVA),两组之间比较应用Student t检验。P0.05被认为存在统计学差异。应用SPSS 18.0软件分析处理数据。所有数据均重复三次。研究结果：1.小鼠的体重及血清学检测指标lenti-null组和lenti-visfatin组小鼠在血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平不存在显著性差异(P0.05),表明lenti-visfatin的局部转染并不影响小鼠体内脂质代谢水平。2. Visfatin慢病毒转染后在颈动脉斑块内表达的检测在转染后的第3天,组织内mRNA水平明显升高(P0.05),而蛋白水平却无明显变化(P0.05)。转染后第7天,组织内mRNA水平和蛋白水平均明显升高(P0.05)。4周后,lenti-visfatin组中visfatin的表达仍然显著高于lenti-null组(P0.05)。以上结果表明,visfatin慢病毒转染成功上调了小鼠颈动脉组织中visfatin的表达。3. Visfatin在颈动脉斑块内主要表达于单核-巨噬细胞visfatin和巨噬细胞免疫荧光共定位结果显示,在颈动脉斑块内,visfatin的绿色荧光与巨噬细胞的红色荧光存在高度重合区域,而在非MOMA-2阳性区域也存在少量绿色荧光,表明visfatin主要来源于斑块内的巨噬细胞,少量表达于其他细胞中。4. Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内巨噬细胞的影响对小鼠颈动脉冰冻切片行MOMA-2染色。结果显示,lenti-visfatin组与lenti-null组相比,巨噬细胞占斑块面积的比例显著增加(P0.05),表明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞的聚集明显增加。5. Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内脂质聚集的影响对小鼠颈动脉冰冻切片行油红0染色,检测颈动脉斑块内脂质的聚集情况。结果发现,lenti-visfatin组与lenti-null组相比,脂质占颈动脉斑块面积的比例明显升高(P0.05=,说明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞的聚集明显增加。6.Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内平滑肌细胞的影响对小鼠颈动脉冰冻切片行α-SMA染色,检测斑块内平滑肌细胞的聚集情况。结果发现,lenti-visfatin组与lenti-null组相比,平滑肌细胞占颈动脉斑块的面积明显减少(P0.05=,表明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内平滑肌细胞数目减少。7. Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内胶原表达的影响对小鼠主动脉窦冰冻切片行天狼猩红染色,检测小鼠AS斑块内胶原纤维表达的情况。结果发现,lenti-visfatin组与lenti-null组相比,胶原纤维占颈动脉斑块面积的比例明显减少(P0.05),表明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内胶原含量减少。8. Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块稳定性的影响斑块的稳定性是通过易损指数进行评定的。易损指数=(巨噬细胞占斑块面积的比例+脂质占斑块面积的比例)／(平滑肌细胞占斑块面积的比例+胶原占斑块面积的比例)。经计算后发现,与lenti-null组相比,lenti-visfatin组中斑块的易损性明显增加(P0.05=,表明visfatin高表达慢病毒转染可增加小鼠颈动脉斑块的不稳定性。9. Visfatin高表达慢病毒转染上调颈动脉斑块内MMP-8表达对小鼠颈动脉冰冻切片行免疫组化染色和western blot检测。免疫组化染色结果显示,lenti-visfatin组与lenti-null组相比,小鼠颈动脉斑块内MMP-8的表达明显增加(P0.05)。Western blot检测结果与免疫组化一致。这一结果说明,visfatin高表达慢病毒转染可使小鼠颈动脉斑块内MMP-8的表达上调。10. Visfatin上调RAW264.7巨噬细胞细胞中MMP-8表达呈浓度依赖性和时间依赖性培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,并给予不同浓度visfatin(0、0.5、5、50和500 ng/ml)刺激。刺激24h后,应用western blot法检测MMP-8的蛋白表达。结果显示,随着visfatin刺激浓度的增加,MMP-8表达逐渐增加,且呈剂量依赖性(P0.05)。5 ng/ml的visfatin刺激可显著升高MMP-8水平,当visfatin浓度为500 ng/ml时,MMP-8的表达达到顶峰。而后以浓度为500 ng/ml的visfatin刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞,刺激时间分别为0、3、6、12、24和48 h。结果显示,visfatin刺激12h可显著增加visfatin水平,在24h时其水平达到顶峰(P0.05)。PCR的结果与western blot类似。应用免疫荧光检测RAW264.7小鼠巨噬细胞内MMP-8的表达。结果显示,用500ng/ml的visfatin刺激24h后,RAW264.7小鼠巨噬细胞内MMP-8的表达明显增加(P0.05)。综上所述,visfatin可同时在体内及体外显著增加MMP-8的表达,MMP-8表达增加可进一步降低血管内胶原从而增加了斑块的易损性。11. Visfatin上调RAW264.7小鼠巨噬细胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9的表达Western blot法检测小鼠颈动脉斑块内MMP-1、MMP-2和MMP-9的表达。结果显示,lenti-visfatin组中MMP-1、MMP-2和MMP-9表达较lenti-null组明显增加(P0.05)。用500ng/ml的visfatin分别刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞不同时间长度,western blot结果显示,visfatin刺激24h内,MMP-1、MMP-2和MMP-9的表达无明显变化(P0.05),但刺激时间延长至48h时,MMP-1、MMP-2和MMP-9的表达明显升高(P0.05)。与visfatin刺激12h即可使MMP-8表达明显增加相比,我们推测visfatin对MMP-1、MMP-2和MMP-9影响不是直接的。12.NF-κB信号通路调控visfatin诱导的MMP-8上调Visfatin(500ng/ml)刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞可显著增加核内p65的水平及降低胞浆内p65的水平(P0.05),且呈时间依赖性。同时,胞浆内IκBα的磷酸化水平也明显升高。在刺激8h后,p65和IκBα的升高具有统计学意义(P0.05),在12h时达到峰值(P0.01)。为进一步探究NF-κB通路的作用,我们将两种NF-κB通路抑制剂BAY11-7082(200M)和SC-514(20μM)预先加入至细胞内,而后再给予visfatin刺激,结果显示这两种抑制剂均可显著降低visfatin诱导的MMP-8表达。以上结果表明,NF-κB信号通路的激活和转位在visfatin诱导的MMP-8表达中发挥重要作用。结论：1. visfatin与实验性小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性密切相关；2. visfatin慢病毒转染可显著降低AS斑块的稳定性；3.visfatin可促进MMP-l、2、8、9的表达,且呈剂量和时间依赖性；4. visfatin通过NF-κB途径促进MMP-8的表达。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
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本文编号：1767014