低能量体外冲击波通过脂肪干细胞改善糖尿病膀胱功能障碍的机制研究

发布时间：2018-04-22 17:46

  本文选题：低能量体外冲击波 + 脂肪干细胞　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景糖尿病是人类常见的慢性疾病,会引起神经、血管的病变,导致一系列的并发症,主要有高血压和心脏病变,晚期可并发视网膜病变、末梢血管病变、外周神经病变甚至内脏器官的损害(比如糖尿病肾病)等。而在泌尿系统的其他并发症中,膀胱功能障碍(diabetic bladder dysfunction, DBD)作为一种常见并发症,大约在所有糖尿病患者中占80%左右。DBD主要表现为储尿期和排尿期症状,并不会对患者的生命有威胁,但对患者的生活质量影响甚巨。目前,针对DBD的治疗方法主要是以缓解其症状为主,并不能对其进行有效的治疗,所谓治标不治本。近些年来,各研究人员都在竭力寻找治疗DBD的有效方法,在这个时候,脂肪组织来源干细胞(adipose tissue derived stem cells, ADSCs)的移植治疗进入了人们的视野。ADSCs是类似于骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)的一种干细胞,同样具有潜能可多向分化为脂肪细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等,同时,由于脂肪在体内含量丰富且极易获取,因此,获取脂肪提取ADSCs进行研究,已经是组织修复医学中的一个热点研究方向。在既往的研究中,有学者发现ADSCs对受损的大鼠盆腔神经节有很好的修复作用,而且可以应用于勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)的治疗中,它能够促进受损海绵体神经的修复。对于ADSCs发挥作用的机制,目前的研究仍尚未得出明确的结论,近期的研究认为ADSCs的旁分泌功能可能是其发挥作用的重要途径。在上个世纪90年代起,体外冲击波治疗(shock wave therapy, SWT)就已经被应用于泌尿系结石的治疗。而随着科技及社会的进步,SWT的应用越来越广泛,非聚焦低能量体外冲击波(defocused low-energy shock wave, DLSW)在组织修复领域的应用亦被越来越多的研究人员关注,而既往有研究报道了DLSW对糖尿病相关并发症(糖尿病溃疡或软组织损伤等)的治疗效应。关于DLSW发挥治疗效应过程中存在的机制,已有的研究都无法很好地进行解释。在关于其治疗机制的学说中,我们越来越倾向于DLSW对干细胞的募集和促进作用,这个学说是假设DLSW可以激活干细胞、促进干细胞向受损部位募集、增强干细胞发挥的作用,但其中涉及的机制也仍不清楚。因此,为了更好的探讨DBD的有效治疗方法,本研究将ADSCs和.DLSW同时应用于治疗DBD大鼠,来探讨其治疗效应及可能存在的治疗机制。目的探讨DLSW对ADSCs的影响和作用,以及其作用过程中可能存在的机制；同时,将DLSW和ADSCs用于治疗DBD大鼠的效果,在治疗过程中DLSW对ADSCs的促进作用。材料和方法1、细胞实验(1) ADSCs的分离培养：提取雌性SD大鼠腹部性腺周围的脂肪,应用3%戊巴比妥对大鼠进行全身麻醉,常规给大鼠备皮后,碘伏消毒、铺洞巾,取大鼠下腹正中切口,取其性腺周围的脂肪2-3m1放入冰的PBS中,缝合大鼠腹部切口。采用胶原酶I进行消化脂肪,分离出ADSCs,置于细胞专用培养基中,在设定为37℃、5%CO2条件的细胞孵育箱中培养。2天后,去除仍未贴壁的细胞,并更换细胞培养基,而后每3天更换细胞培养基一次,当细胞生长至覆盖住培养瓶90%以上的空间时,予以传代。(2) DLSW治疗：每次细胞传代前,将培养的ADSCs置于SWT机器下,进行DLSW治疗,记为治疗组ADSCs,同时,将未进行DLSW治疗的细胞记为对照组ADSCS。于装有贴壁ADSC的培养瓶表面涂抹超声凝胶,将之置于冲击波治疗探针下方并与之接触,用EFD为0.1mJ/mm2能量的DLSW以120次／分钟的频率对ADSCs进行治疗。DLSW治疗后24小时,无菌条件下进行细胞传代。治疗组ADSCs一共接受DLSW治疗5次。(3)两组细胞在每次传代后均进行细胞形态学上的检测对比,并用鬼笔环肽进行细胞骨架染色,以进一步比较两组细胞的差异。(4) ELISA检测：每次体外冲击波治疗完成后,将治疗组ADSC和对照组ADSC的培养基均更换为3ml不含FBS的培养基。24小时后,将培养基收集至EP管中,1200rpm离心10分钟后,置入-80℃冰箱中保存,以待不同代的培养基收集齐全后同时进行检测。为消除偏差,两组细胞的培养基应同时收集、储存并同时检测。利用ELISA试剂盒检测治疗组和对照组的大鼠ADSC培养基(P1～P5)中的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和CXC配体5(CXC ligand 5, CXCL5)的水平。两组细胞均采用第4代细胞进行进一步实验。(5)流式细胞术检测：选择P4的治疗组ADSC和对照组ADSC同时进行流式细胞术检测,以观察其细胞表面抗原的变化。检测细胞表面抗原包括CD34、Stro-1、 OCT、CD106、CD29和CD49d。(6)细胞增殖能力检测：为了检测细胞的增殖功能,将P4期的ADSCs应用EdU进行标记过夜,然后采用EdU细胞增殖检测试剂盒进行检测。应用EdU标记细胞法来检测DLSW对ADSCs增殖能力的促进作用。同时,应用Western blot检测细胞增殖指标——增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和Ki67蛋白的表达水平。(7)细胞迁移能力检测：检测两组细胞CXCR2的表达水平及细胞迁移能力。为了检测细胞的迁移功能,首先检测P4期的治疗组和对照组的细胞中CXCR2蛋白的变化。采用免疫荧光染色和Western blot两种方法来检测CXCR2的表达水平。细胞迁移实验中,采用趋化因子CXCL5作为诱导剂,诱导细胞进行迁移。(8)应用Western blot检测两组细胞内的细胞传导通路的变化,包括MAPK信号通路、JAK/STAT信号通路、PI-3K/AKT信号通路和NF-κB信号通路的变化。另一方面,采用相应的信号通路阻断剂进行干预后,再检测两组细胞的分泌功能和增殖功能的变化。2、动物实验(1)实验设计。随机选择10只大鼠,拿来当做正常对照组(N组),喂养普通食物；另外选取30只作为糖尿病组,首先给予高脂肪饮食(high fat diet, HFD)喂养30天,然后分2次按30mg/kg经大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),间隔时间为1周。整个实验过程,两组大鼠的喂养食物不变。糖尿病大鼠需要定时记录其空腹血糖,当大鼠的空腹血糖≥7.8mmol/L后,且多次测量均维持在此水平,才能继续进行下一步的实验。注射STZ后3个月,在30只糖尿病大鼠中,随机选取20只大鼠经腹腔获取脂肪,用来提取、培养ADSCS。为了进行ADSCs的体内追踪,应采用10μM的EdU对ADSCs进行过夜标记,然后计数出3×106个细胞,用0.5ml的PBS稀释后,经尾静脉注射回大鼠体内。随机将这30只糖尿病大鼠分成3组：第1组,经大鼠尾静脉注射0.5ml的PBS,不做其他处理(糖尿病对照组,DM组,n=10)；第2组,经大鼠尾静脉向大鼠体内注射0.5ml PBS稀释的3×106个自体ADSCs,不做其他处理(ADSC组,n1=10)；第3组,经大鼠尾静脉向大鼠体内注射0.5ml PBS稀释的3×106个自体ADSCs后,第2天即予以DLSW冲击大鼠腹部(ADSC+SW组,,1=10)。此外,正常对照组(N组)的大鼠也应该在同时经大鼠尾静脉注射0.5ml的PBS。(2)清醒状态下测定大鼠的膀胱内压。进行膀胱内压测定前24小时,分别向膀胱内和腹腔中各留置一根聚乙烯-90导管(导管一端连接乳胶球囊)用来测量膀胱内压和腹腔压力。为了排除大鼠自身膀胱活动的影响,在正式记录压力数据前,应该让大鼠先适应一段时间再正式测定,测量膀胱内压时需要持续1小时,记录测定的数值进行后续分析。(3)膀胱组织中EdU标记的ADSCs的定量和细胞凋亡的定量。为检测ADSCs募集至膀胱损伤组织中的情况,我们用EdU标记的ADSCs在评估组织中的定量(即高倍镜视野中EdU阳性ADSCs的数目)来表示,我们先在荧光显微镜的高倍镜视野中观察EdU阳性ADSCs并采集图像,然后借助Image-Pro Plus软件来计算EdU阳性的ADSCs数目。为检测经DLSW治疗后膀胱组织切片中细胞凋亡的情况,我们采用TUNEL试剂盒染色来检测细胞的凋亡,然后在荧光显微镜下进行观察,并借助Image-Pro Plus软件分析凋亡细胞的数目。(4)免疫荧光染色和免疫组织染色。3、统计学分析收集各组实验数据,使用SPSS 19.0软件对其进行统计学分析。应用单因素方差分析来分析各组之间的连续型数据的比较,而各组大鼠的膀胱功能改善情况则利用Fisher卡方检验进行比较。本研究中的所有数据均采用(平均值±标准差)来表示。只有当P0.05时,才代表两组间的差异具有统计学差异。结果1、细胞实验(1)经DLSW治疗的ADSCs与未经治疗的ADSCs的形态并无明显差别,细胞骨架染色亦未见明显变化,说明DLSW并无破坏ADSCs的形态特征。(2)流式细胞检测中,经DLSW治疗的ADSCs与未经治疗的ADSCs表达CD34、 Stro-1、OCT4、 CD106、CD29和CD49d的水平均未见明显差异,表明DLSW并未改变ADSCs的细胞表型。(3) DLSW可增强ADSCs的分泌功能。分泌功能实验中,可见与未经治疗的ADSCs组对比,经DLSW治疗的ADSCs组中VEGF、NGF和CXCL5的分泌浓度均显著增加。(4) DLSW可促进ADSCs的增殖功能。在Western blot检测中,经DLSW治疗的ADSCs表达PCNA和Ki67的水平均比未经治疗的ADSCs明显升高。而在EdU试剂盒检测实验中,可见在经DLSW治疗的ADSCs组中,EdU标记的ADSCs数较未经治疗的ADSCs明显增多。(5) DLSW不仅可以促进ADSCs的体外迁移,并且可以增强ADSCs在体内的迁移能力。在体外迁移实验中,经DLSW治疗的ADSCs组中迁移至下室的细胞明显比未经治疗的ADSCs组多。(6) DLSW是通过MAPK信号通路、PI-3K/AKT信号通路和NF-κB信号通路来激活ADSCs的,通过阻断实验,可以看出,阻断通路后,ADSCs的分泌能力和增殖能力明显减弱。2、动物实验(1)测定膀胱内压实验中,注射经DLSW治疗的ADSCs的大鼠中,有70%大鼠的膀胱功能恢复至正常水平,其余的亦有不同程度的好转,而在对照组中,仅有40%大鼠的膀胱功能恢复至正常水平。说明DLSW亦可辅助ADSCs促进膀胱功能的恢复。(2)大鼠膀胱组织中EdU标记细胞的定量。注射ADSCs后1个月,切取膀胱组织行EdU染色,检测膀胱内EdU标记的ADSCs的数目。结果发现,EdU阳性的细胞在膀胱粘膜下层和肌层中均能观察到(图9A)。在ADSC+SW组大鼠的膀胱组织切片中,膀胱粘膜下层中EdU阳性的细胞数目较ADSC组明显增多；而在肌层中的EdU阳性的细胞数目,两组并无明显差异。(3)细胞凋亡的定量检测。应用TUNEL试剂盒测量细胞凋亡,只有TUNEL和DAPI同时阳性的细胞核才是凋亡细胞核。DM组大鼠中的细胞凋亡数目较N组明显增多(P0.05)。而在ADSC组和ADSC+SW组大鼠的膀胱组织切片中,膀胱粘膜层的凋亡细胞较DM组明显减少(P0.05)。(4)血管的定量检测。在N组大鼠中,膀胱粘膜下层可见丰富的eNOS阳性的血管、连续致密的Col IV表达阳性的毛细血管网。而在DM组大鼠的膀胱粘膜下,上述血管的密度减少,毛细血管网络毛细血管网络不再连续、阳性表达量下降。在ADSC组和ADSC+SW组中,血管的分布以及毛细血管网的连续性和厚度较DM组均有明显改善,而且,ADSC+SW组的改善效果更佳。结论DLSW通过MAPK信号通路、PI-3K/AKT信号通路和NF-κB信号通路来激活ADSCs,以促进ADSCs的分泌、增殖和迁移功能,且并不会改变ADSCs的形态以及表型。此外,DLSW可以通过激活ADSCs的作用来发挥作用,改善DBD大鼠的膀胱功能。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2

【参考文献】

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1 双卫兵;王东文;;糖尿病膀胱研究进展[J];中华泌尿外科杂志;2006年03期

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本文编号：1788270