淫羊藿苷联合糖皮质激素对EAE鼠发病的干预及HPA轴影响的研究

发布时间：2018-05-25 19:09

本文选题：淫羊藿苷 + 糖皮质激素　；参考：《广东药学院》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫病，临床特点为症状体征的空间多发性和病程的时间多发性。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前公认研究MS的动物模型，常用于该病机制和药物治疗作用的研究。目前针对该病仍无特效的治疗方法，较公认的观点是以大剂量糖皮质激素（glucocorticoid,GC）冲击治疗为主，但近来越来越多的研究发现激素冲击后存在一系列严重副反应如严重的骨质疏松、肥胖以及一系列精神障碍性疾病等。随着雌激素对中枢神经系统炎症的保护性作用逐渐被人熟知，并对此进行大量动物实验，结果证明了雌激素对EAE的发病存在明显保护作用，但考虑到诱发肿瘤的风险而存在争议。因此，植物雌激素--一种既有拟雌激素效应又能对体内雌激素水平进行调控效应的药物引起了人们的极大的兴趣。淫羊藿作为植物雌激素的一种，近来被广泛研究用于骨代谢及心血管有关疾病的研究中，均取得颇为满意的结果。我们前期有关EAE的研究中淫羊藿苷（淫羊藿的效应单体,icraiin,ICA）对EAE发病的治疗作用进行了探索，结果已经证实ICA通过拟雌激素效应对EAE具有保护作用，同时对GC具有正性调节作用。本课题拟联合使用具有拟雌激素效应的ICA和外源性GC-甲基泼尼松龙（methylprednisolone,MP）治疗EAE，探索两者是否有协同作用及其机制。研究目的在前期研究的基础上，以C57BL/6雌性小鼠作为构建EAE模型，给予ICA和MP联合治疗，从临床评分、免疫相关因子水平、有关受体蛋白水平、脊髓神经细胞凋亡水平及组织病理等方面观察两者联合使用后对EAE的保护作用，初步探讨其相互作用的机制及对HPA轴的影响。研究方法 1、构建EAE模型 C57BL/6雌性小鼠构建EAE模型。将鼠源MOG35-55多肽与等体积CFA混合制成抗原乳剂，皮内注射于小鼠脊柱两旁（分四点，每个部位50μL），于免疫后第7d加强免疫1次（等剂量MOG及CFA）。在免疫后第0及第48h内腹腔内注射500ng百日咳毒素，免疫后每日进行观察，称重及发病后的评分。 2、EAE模型鼠鉴定 ①临床表现：对神经损害表现进行评分。于免疫第8天开始陆续发病，表现出EAE症状，第13天达到高峰。 ②脊髓组织病理：取腰膨大处脊髓组织于4%多聚甲醛液中固定24小时，自动脱水机中脱水后石蜡包埋，切片进行HE染色及纱罗络花青髓鞘染色。 3、EAE模型鼠分组及治疗将造模成功的EAE鼠随机分为5组，分别为A组：大剂量ICA+MP组；B组：中剂量ICA+MP组；C组：小剂量ICA+MP组；D组：MP组；M组：模型对照组；N组：正常对照组。于免疫接种后第13天，小鼠发病达高峰时开始给药，连续给药5天后，于第18天处死、取材。 4、各组免疫相关因子检查各组血清、血浆因子检测：眼眶取血，离心后取血清检测IL-17、CORT，取血浆检测ACTH，严格按照IL-17ELISA试剂盒、CORT、ACTH放免试剂盒进行操作检测各因子水平。 5、各组脑组织蛋白GR水平检测分别取各组小鼠大脑相同部位→加入含PMSF的组织裂解液研磨→离心取上清液→用BCA法测蛋白浓度→配平→取各组约40ug蛋白→上样→电泳→转膜→漂洗→封闭→孵一抗、二抗→显影。 6、各组流式检测神经细胞凋亡腹腔麻醉小鼠后，用剪取0.5cm长脊髓，以腰膨大处最佳，用PBS及无菌镊及眼科剪将脊髓组织研碎，取浑浊液常温离心两次，弃上清，留白色沉淀，加入50-100ul冰PBS混悬细胞，于显微镜中观察，估计数目为10000以上，于流式细胞仪中检测脊髓组织细胞的凋亡情况，整个操作均于无菌环境中进行。研究结果小鼠于免疫第8天开始发病，于免疫第13天，即发病高峰期给予不同剂量ICA及MP治疗后，临床表现、脊髓组织病理改变及细胞凋亡情况、外周血炎症因子水平、脑组织受体蛋白水平等结果如下： ①体重及临床评分变化情况：A组EAE鼠经治疗后体重较治疗前有明显增加（P=0.0166,P＜0.05），临床评分较疗前下降（P=0.0258,P＜0.05）。其他组小鼠体重评分与治疗前相比较，虽有所改善，且无统计学意义。 ②EAE鼠的血清炎症因子IL-17明显下降，A、B、C、D组分别与M组相比，P＜0.01，差异具有统计学意义，且给予治疗后A、B、C、D组炎症因子水平较N组都减低， P＜0.01，具有统计学意义；其中以A组炎症因子水平下降最为明显，与C、D组差异均具有统计学意义；血清CORT含量变化显示：其中A组血清CORT含量较M组明显下降（P＜0.0001），但与N组无明显差异；C、D组血清CORT水平较M组也有明显下降（P=0.0007，P=0.0053），差异均具有统计学意义，但均高于N组；但B组血清CORT水平较N组却有明显升高（P＜0.0001），但与M组相比无明显差异；血浆ACTH含量变化情况： A、C组较M、N组无明显差异；B组较M、N组虽有所升高，但差异无统计学意义；D组较M、N组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 ③EAE鼠脑组织有关受体蛋白表达影响的变化：A、B、C、D组GR蛋白表达与M组比较均有增加（P＜0.01），但与N组相比，A、C组较N组均明显升高（P＜0.0001）；D组与N组比较却有降低（P=0.0078）；B组与N组无明显差异。 ④脊髓组织细胞凋亡情况：与M组相比，A、B、C、D组细胞凋亡率均明显减低，但仍较N组高；各组间以A组凋亡率下降最为明显，与B、C、D组均有明显差异（P值分别为0.0025,0.0019,0.0004）。结论 ICA通过拟雌激素效应与MP联合应用于EAE可协同降低血清IL-17水平，，血清CORT水平及脊髓组织细胞的凋亡，并能通过增加脑组织GR的表达促进脊髓再髓鞘化，且均与ICA呈剂量依赖性，以大剂量的ICA与MP联用治疗效果最为显著。
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【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R744.51

【参考文献】