炎症微环境响应性纳米药物抑制血管内皮损伤后内膜增生的实验研究

发布时间：2018-07-23 17:38

【摘要】：研究背景冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD)是导致人类疾病性死亡的主要原因,仅在2013年就导致全球约814万人死亡。在大多数情况下,动脉粥样硬化作为一种慢性血管炎症是导致心血管疾病的最主要的病因。经皮冠状动脉介入手术(Percutaneous coronary intervention,PCI)包括球囊扩张血管成形术,斑块旋切术及支架植入术等,是治疗CAD(急性心肌梗死和急性冠脉综合征等)常用的非外科手术治疗方式。PCI术中对内皮的机械损伤导致血管内皮损伤局部血栓形成及血管新生内膜过度增生,进而发生血管再狭窄,是导致手术失败需要二次PCI的主要病因。PCI术后局部血管炎症反应在血管再狭窄的发生发展过程中起了关键作用,PCI术中对内皮的损伤或者剥脱,使血小板迅速聚集在受损局部,除了导致血栓形成以外,血小板激活后通过血小板表面受体募集血液循环中的白细胞,随即白细胞、激活的血小板及炎性内皮释放包括肿瘤因子坏死-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF),碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,b FGF),白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等一系列促炎症因子,诱导血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖和迁移,促进细胞外基质合成,最终形成新生内膜,导致血管再狭窄的发生。针对血管再狭窄的病理生理特性,目前已研发出多种药物,包括抗凝药物、抗炎药物、抗细胞增殖药物和抗血小板药物。其中很多药物属于系统性给药,血管内皮损伤局部药物浓度较低,为了提高药物在损伤部位的浓度往往需要提高给药剂量,导致药物副作用的发生,比如抗血小板及抗凝药物导致的出血不良反应等。药物洗脱支架虽然明显降低了血管再狭窄发生率,但是支架涂层药物因其没有选择性往往会导致再内皮化延迟,需要长期双抗血小板治疗(Double anti-platelet therapy,DAPT),另外支架作为一种异物长期存也会刺激血管产生局部炎症反应,导致有约5-10%的病人仍会发生血管再狭窄。最近大量研究表明,纳米医学在炎症相关疾病包括心血管疾病的诊断和治疗上取得了一些极具应用前景的进展。血管内皮损伤局部存在着过量的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS),在PCI术后血管再狭窄的发生发展过程中起着重要作用。另一方面,血管内皮损伤局部的炎症反应存在着微酸性环境。针对上述问题,本研究设想构建炎症微环境响应性纳米药物来预防血管再狭窄的发生。为此,我们基于β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)设计合成酸响应性载体材料(Ac-b CD)和ROS响应性载体材料(Ox-b CD),以抗VSMCs增殖的药物RAP作为包载药物,制备相应载药纳米粒,通过体内外实验评价其预防血管内皮损伤后内膜增生的效果。研究内容1.炎症微环境响应性β-CD材料的合成1.1酸响应性材料缩醛化β-CD(Ac-b CD)的合成1 gβ-CD和160 mg吡啶对甲苯磺酸盐(PTS)加入至8 m L无水二甲基亚砜(DMSO)中,磁力搅拌下充分溶解后,加入4.5 m L的催化剂2-乙氧基丙烯(EP)。3 h后,加入三乙胺终止反应。产物加入去离子水彻底洗涤沉淀离心后冻干即得。1.2 ROS响应性环糊精材料(Ox-b CD)的合成2 g 4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯(PBAP)溶解在12 m L无水二氯甲烷中,加入2.8 g1,1’-羰基二咪唑(CDI)室温活化PBAP。室温反应30 min后,加入14 m L的二氯甲烷,去离子水彻底清洗三次。收集的有机相用饱和氯化钠溶液清洗三遍,无水硫酸钠干燥1 h即获得CDI活化的PBAP。之后,1.5 g CDI活化的PBAP与250 mgβ-CD溶解在20 m L无水DMSO中,将0.8 g的4-二甲基吡啶(DMAP)加入至上述溶液中,室温条件下磁力搅拌12 h。最终产品用去离子水沉淀离心后彻底洗涤三次冻干获取。材料经傅里叶转换红外光谱(FT-IR)和1H核磁共振谱(NMR)进行结构分析及验证。2.载雷帕霉素纳米粒的制备采用改进的纳米沉淀-自组装法制备载雷帕霉素(RAP)纳米粒。具体过程为,精确称取50 mg Ac-b CD或者PLGA材料和10 mg RAP溶解在2 m L乙腈(Ox-b CD载体材料用甲醇作为有机溶剂溶解)中得到油相,卵磷脂乙醇溶液(4mg,0.4 m L)和DSPE-PEG2000(6 mg)溶解在9.6 m L的去离子水中得到水相。水相在65°C油浴条件下加热0.5 h后,将油相以1 m L/min的速度逐滴加入至水相中。室温条件下搅拌反应2 h挥发有机溶剂,以16000 rpm的速度离心并使用去离子水洗三次分别获得载雷帕霉素PLGA(RAP/PLGA),Ac-b CD(RAP/Ac-b CD)及Ox-b CD(RAP/Ox-b CD)纳米粒。Cy5或Cy7.5标记的相应纳米粒由同样的方法制备。3.纳米粒的理化性质表征纳米粒的粒径分布、大小及Zeta电位由马尔文粒径仪测定。将制备的纳米粒溶液滴至铜网膜上,室温挥干后表面形态由透射电子显微镜(TEM)观察并采集图像。载RAP纳米粒由乙腈/甲醇混合溶液溶解破乳后,载药量由高效液相色谱法(HPLC)测定。Cy5或Cy7.5含量由荧光光谱仪测定。4.空白纳米粒体外水解实验空白Ac-b CD纳米粒分别分散于p H 5.0或7.4的PBS缓冲液中。空白Ox-b CD纳米粒分散于浓度梯度的H2O2/PBS缓冲液中。于不同时间点采集样品采用紫外-可见分光光度计测量500 nm处的透光率。空白PLGA纳米粒作为非响应性载体材料对照以同样的方法测定相应透光率。以透光率数据计算相应纳米粒水解的程度。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验RAP/Ac-b CD纳米粒分别分散于8 m L p H值5.0或7.4的PBS缓冲液中,RAP/Ox-b CD纳米粒则分散于8 m L含或不含1 m M H2O2的PBS缓冲液中。于不同时间点采集样品并补充相应量溶液,HPLC测定药物浓度,绘制不同纳米粒药物释放曲线。同样的方法以RAP/PLGA纳米粒作非响应性载体材料对照绘制相应药物累计释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验SD大鼠(180-200 g)安乐死后取胸主动脉,大鼠原代血管平滑肌细胞(r VSMCs)由组织块贴壁法分离并培养。第3-6代的r VSMCs用于后续实验。r VSMCs以3×105个/孔的密度接种于6孔板中。孵箱继续培养24 h后加入不同浓度梯度的Cy5标记纳米粒与细胞共孵育,另取同一浓度的纳米粒与细胞孵育不同时间,溶酶体荧光标志物(lyso-tracker green)染色标记晚期核内体/溶酶体,DAPI染核,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察采集图像。另采用流式细胞术(FACS)进一步定量分析细胞吞噬纳米粒量。7.载雷帕霉素纳米粒抗r VSMCs迁移的作用研究采用Transwell小室检测RAP不同制剂对血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导的r VSMCs迁移的影响。r VSMCs以2×105个/孔的密度接种于12孔板。孵箱继续培养24 h后改为含有0.5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养,加入PDGF-BB(20 ng/m L)及RAP终浓度为1μM的不同RAP制剂(RAP原料药,RAP/PLGA NP,RAP/Ac-b CD NP,RAP/Ox-b CD NP)。6 h后胰酶消化收集细胞加至Transwell小室上层,下层加入PDGF-BB(20 ng/m L),分别设置阴性及阳性对照。孵箱静置8 h待上室细胞往下室迁移,棉签轻轻擦去上室细胞,迁移至Transwell小室下层的细胞用0.3%结晶紫染色。光学显微镜高倍条件拍照计数并进行统计学比较。8.载雷帕霉素纳米粒抗r VSMCs增殖的作用研究r VSMCs以5000个/孔的密度接种于96孔培养板,孵箱继续培养24 h后改为含有0.5%FBS的DMEM培养基,加入PDGF-BB(20 ng/m L)及RAP终浓度为1μM的不同RAP制剂(RAP原料药,RAP/PLGA NP,RAP/Ac-b CD NP,RAP/Ox-b CD NP),分别设置阴性及阳性对照。继续培养24 h后,CCK-8法检测细胞的活力。9.空白纳米粒的细胞毒性实验研究r VSMCs以1×104个/孔的密度接种于96孔培养板,24 h后加入浓度梯度的空白纳米粒(PLGA NP,Ac-b CD NP,Ox-b CD NP),继续培养24 h后CCK-8法检测细胞的生存能力。10.载体材料空白纳米粒的体内急性毒性评价雄性SD大鼠(180-200 g)随机分成4组(n=3)。大鼠采用尾静脉注射的方式分别注射500 mg/kg的PLGA NP、Ac-b CD NP或Ox-b CD NP,对照组大鼠尾静脉注射生理盐水,监测大鼠体重及其活动行为。于给药后第14 d对大鼠实施安乐死,收集血液样本进行血液指标分析,主要器官称重计算脏器指数并行苏木精-易红(HE)染色观察其病理变化。另体外溶血试验检测纳米粒的安全性,采集大鼠血液制备2%红细胞悬液,与不同浓度梯度的PLGA NP、Ac-b CD NP或Ox-b CD NP共孵育2 h后,离心测上清中血红蛋白浓度。11.大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立及损伤部位ROS水平的检测雄性SD大鼠麻醉后,脱毛膏去除颈部毛发,颈部消毒后正中切口暴露颈总、颈内及颈外动脉,Edwards 2F取栓导管球囊经由颈外动脉切口插入颈总动脉,充盈球囊至适当阻力,旋转拖拉球囊三次彻底去除颈总动脉血管内皮,尾静脉注射伊文思蓝溶液检测内皮损伤情况,模型建立后14 d后取材切片HE染色观察内膜增生情况。成功建立大鼠颈动脉损伤模型之后,取材行DHE染色检测局部超氧阴离子表达水平,并通过试剂盒检测损伤局部过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)水平。12.纳米粒靶向于血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤后,经尾静脉即刻分别注射Cy7.5标记的三种荧光纳米粒(Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/Ac-b CD NP,Cy7.5/Ox-b CD NP),体内循环8 h后,取损伤段颈动脉及主要脏器行小动物荧光成像(IVIS)观察其在血管内皮损伤部位靶向情况及组织分布。另外,颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5/Ac-b CD纳米粒于不同时间点取损伤段颈动脉成像观察分析靶向情况和滞留时间。13.载雷帕霉素纳米粒抑制大鼠颈动脉内皮损伤后新生内膜形成的研究雄性SD大鼠随机分成六组(n=5):假手术组,生理盐水治疗组,RAP原料药组,RAP/PLGA纳米粒组,RAP/Ac-b CD纳米粒组,RAP/Ox-b CD纳米粒组。颈动脉损伤模型制备成功后,分别于损伤后立即(0 d),3 d,7 d,11 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同RAP制剂。第14 d大鼠行安乐死,灌注后取损伤段血管,切片后HE染色观察内膜增生情况,免疫组织化学分析检测相关标志物表达水平。研究结果1.炎症响应性材料及纳米粒的合成和制备以β-CD为原料,采取一步法缩醛反应合成了酸响应性材料Ac-b CD,FT-IR和1H NMR证实合成成功。ROS响应性材料Ox-b CD则是通过在β-CD上键合氧化敏感响应性基团PBAP得到,FT-IR和1H NMR证实合成成功,根据1H NMR结果积分计算表明每个β-CD分子上结合有7个单位的PBAP。以非响应性载体材料PLGA为对照,采用纳米沉淀-自组装法成功制备了三种材料的载RAP纳米粒,透射电镜观察示,纳米粒呈球形,形态规则,粒径分布均一。马尔文粒径仪测定纳米粒粒径示RAP/PLGA纳米粒、RAP/Ac-b CD纳米粒和RAP/Ox-b CD纳米粒的粒径分别约为215、238和212nm。2.纳米粒的体外水解和药物释放实验相比在PBS(p H 7.4)下,Ac-b CD纳米粒在p H 5.0的PBS中水解迅速,药物释放快速,具有良好的酸响应性。相比PBS(p H 7.4)条件下,Ox-b CD纳米粒水解和药物释放与H2O2密切相关,在H2O2存在条件下,材料快速水解,药物释放迅速,具有良好的氧化响应性。PLGA纳米粒在微酸环境和H2O2环境下的水解与其在PBS(p H 7.4)中的水解和药物释放。3.纳米粒的细胞吞噬实验激光共聚焦及流式细胞术定量分析示,r VSMCs可实现对纳米粒的吞噬,且呈时间和浓度依赖性,细胞纳米粒吞噬过程主要由胞内内涵体/溶酶体介导。4.雷帕霉素不同制剂抗血管平滑肌细胞增殖和迁移作用的比较载RAP纳米制剂较RAP原料药能更明显的抑制PDGF-BB诱导的r VSMCs的增殖和迁移,并且载RAP不同纳米粒之间比较,载RAP响应性纳米粒抑制r VSMCs增殖和迁移能力的效果最显著。5.大鼠颈动脉球囊损伤部位的ROS水平伊文思蓝染色及HE染色示,大鼠颈动脉球囊损伤部位血管成功去内皮化,新生内膜形成明显。与正常血管相比,颈动脉内皮损伤部位DHE染色显示超氧阴离子水平明显升高,损伤部位H2O2和MDA水平显著升高,提示ROS与内膜增生密切相关。6.三种载体材料纳米粒对大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向情况与正常血管相比较,Cy7.5标记的三种不同载体材料构建的纳米粒均可以在大鼠颈动脉损伤段明显靶向和聚集,且可以滞留较长时间。7.雷帕霉素不同制剂抑制颈动脉内皮损伤后内膜增生的药效研究载RAP纳米制剂较RAP原料药能更有效的抑制内膜增生的程度。另外载RAP不同纳米粒之间比较提示,载RAP响应性纳米粒组较PLGA纳米粒组抑制内膜增生的的效果更显著。免疫组织化学染色结果表明载RAP炎症微环境响应性纳米粒组SMα-actin阳性细胞数目和PCNA阳性细胞数最少,MMP-9的表达显著下降。8.响应性纳米材料的初步安全性评价三种材料构建的空白纳米粒对r VSMCs活力基本影响。三种材料构建的空白纳米粒与血液样本共孵育未见明显溶血现象发生。大鼠体内急性毒性评价提示,尾静脉注射500mg/kg响应性空白纳米粒后14 d,未见明显动物行为异常,体重,脏器指数,血常规,血生化指标(肝肾功标志物)与生理盐水对照组相比无明显差异,主要脏器HE染色未见明显病理学改变。提示响应性纳米材料体内安全性良好。研究结论1.基于β-环糊精成功合成酸响应性的Ac-b CD材料和ROS响应性的Ox-b CD材料,并成功制备了相应载RAP纳米粒。2.不同载体材料构建的纳米粒均能被r VSMCs有效吞噬。载RAP炎症微环境响应性纳米粒能够显著抑制PDGF-BB诱导的r VSMCs增殖和迁移3.构建的炎症微环境响应性纳米粒可靶向聚集于大鼠颈动脉球囊损伤部位。4.与RAP原料药和载RAP非响应性材料PLGA纳米粒相比,载RAP炎症微环境响应性纳米粒能更有效地抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的新生内膜形成。5.响应性载体材料具有良好的体内安全性和组织相容性。虽然其确切机制尚有待进一步阐明,但本实验构建的微环境响应性纳米体系为PCI术后血管再狭窄及其他炎症相关疾病的预防和治疗提供了新的研究思路,研究方法和研究手段,具有良好的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.3
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本文编号：2140142