吲哚美辛提高脂肪移植保留率的实验研究及相关机制探讨

发布时间：2018-08-02 16:34

【摘要】：研究背景和目的脂肪移植近年来作为软组织修复重建的新兴技术一直被广泛应用于多个领域,如烧伤后的继发畸形、慢性创面、创伤、放射性损伤以及肿瘤切除术后的继发缺损。随着现代医学的发展,尽管外科技术水平不断提高,尤其是BRAVA的出现和预处理脂肪移植受区使移植效果大大提高,脂肪移植技术仍面临着供区不足以及移植最终保留率的不可预测性的难题。为了获得更好的移植细胞的存活,细胞辅助的脂肪移植技术近年来在整形外科领域大受欢迎,尤其是SVF(stromal vascular fraction)细胞参与的脂肪移植技术被证实可以提高移植效果。SVF细胞是一类极具发展潜力的细胞群,对于移植物中血管化的快速建立大有脾益,因其具有多向分化潜力,通过脂肪抽吸术容易大量获得而在细胞辅助脂肪移植中得到应用。然而,一项特定的限制因素是在临床上需抽吸约双倍量的脂肪分别用于移植和提取处理SVF细胞,这对于某些严重软组织缺失的患者是不可行的。另外,这也同时使原有手术时间大大延长,需要60-90分钟来分离提取SVF。另外一个我们关注的问题是SVF中的ASC(adipose-derived stem cell)的数量及功能在不同患者中并非一个固定参数,因而使得最终脂肪保留率更加难以预测。近年来,与传统脂肪移植技术相比,如何简化脂肪移植流程、缩短手术时间但又不降低最终保留率成为整形外科医生感兴趣的话题。最新的研究逐渐把目光投向了吲哚美欣,其本质是一种甾体抗炎药,目前已广泛应用于临床。然而,吲哚美欣同时也是成脂基因PPAR-γ的配体,最新研究证实,吲哚美辛在体外可以促进脂肪干细胞的成脂并发现成脂基因表达明显抬高。另有研究表明,吲哚美辛作为非甾体类抗炎药,与间充质干细胞(MSC)共同置入包裹性的水凝胶材料时可大大挽救移植细胞(MSC),可减少宿主免疫系统对移植细胞的侵袭,并通过调节局部微环境从而阻止促炎性细胞因子诱导的凋亡过程。这些数据提示了吲哚美欣与炎症反应密切相关,与脂肪移植联合应用可能提高最终保留率。因此,我们大胆假设添加吲哚美欣一方面可通过上调PPAR-γ的表达启动成脂过程,另一方面,通过调控炎症反应强度保护移植组织中的脂肪前体细胞,进而促进原本存在的ASC在成脂环境下进入成脂分化过程。为验证该假说,本实验组采取两项独立补充性实验来探讨吲哚美欣的促成脂效应。首先,为了检测吲哚美欣促成脂效应的最适宜浓度,本实验组将各个浓度梯度的吲哚美欣与条件培养基混合培养ASC并观察最佳成脂分化组,同时检测各添加组及对照组成脂基因表达情况以此获得最适宜浓度。另外,建立小鼠的脂肪移植模型观察体内情况下各组的最终保留率。尽管吲哚美辛早已被FDA批准适用于临床的多个方面,但作为药物性添加剂应用于脂肪移植领域以及作为培养基添加剂培养人类ASC却从未有此类研究报道,因而本实验作为前瞻性实验对于简化脂肪移植流程和提高最终移植效果具有积极的探索性意义。方法1、人条件培养基及Zuk培养基的准备本次实验研究使用患者腹部脂肪抽吸术后的废弃游离脂肪,新鲜获取的脂肪抽吸物用PBS清洗数次以洗去多余油滴和其他液体,然后以1:3的比例置于完全培养基(DMEM、10%胎牛血清、1%盘尼西林-链霉素、1%葡萄糖)内,在37℃、5%二氧化碳和95%的湿度条件下培养24 h。将孵育培养过后的培养基过滤以移除多余残渣。将此过滤后的条件培养基分装后放入-20℃冰箱冻存备用。需制备促成脂作用的Zuk培养基作为阳性对照。按文献所得,将DMEM,10%胎牛血清,0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX),1 μM地塞米松,10 μM胰岛素,200 μM吲哚美辛,and 1%抗生素混合即为Zuk成脂培养基。同样过滤后分装、冻存备用。2、人ASCs的分离提取和培养使用患者脂肪抽吸术后获得的废弃脂肪组织,将之充分剪碎后,用0.1%的I型胶原酶消化50min,期间充分震荡使脂肪组织与胶原酶充分接触。然后300g离心5min,弃上清液,用完全培养基将细胞重悬,用100 μm的尼龙网过滤后再以700g离心5min。弃上清液,用PBS彻底洗涤离心后的细胞,再次用完全培养基重悬后,分装至培养皿培养。于次日更换新鲜培养液,将已贴壁90%的ASCs消化下来后,分装并冻存于液氮以备随时使用。3、吲哚美欣最佳浓度测定的体外实验健康的人ASCs以2.0 × 104/孔接种至24孔板中,在完全培养基下培养至80%细胞聚集后,于第二日更换不同的条件培养液,依次更换为完全培养基(阴性对照)、Zuk培养基(阳性对照)和实验组中的成脂诱导培养基。在实验处理组中,以递增浓度梯度的形式将吲哚美辛添加至上述已配置完好的条件培养液中,形成50,100,150,and 200 μ浓度的富含吲哚美辛的条件培养液,以确定吲哚美辛促成脂作用的最适宜浓度。同时,制备Zuk培养液与200 μ吲哚美辛的混合培养液,使吲哚美辛达到400μM的更高浓度。连续培养2周,每3天换一次培养基。所有分组为:完全培养基(Cm)、Zuk、条件培养基(Cd+50μM indo;Cd+100μM indo;Cd+150μM indo;Cd+200μM indo;uk+200μM indo)。4、油红O染色及定量分析为检验ASC的分化程度,ASCs培养2周后进行油红O染色鉴定。10%的福尔马林液固定细胞,充分固定后洗涤,然后以油红O溶液(稀释于60%异丙醇溶液)染色1h后PBS多次清洗,然后加入1ml/孔的苏木精染色液染色5min。移除苏木精染液后,每孔加入1ml新鲜蒸馏水并至于光镜下观察拍照。为了将摄入油红O染料的脂滴提取出来,每孔加入1ml异丙醇溶液,室温下温和震荡15min,期间更换3次异丙醇溶液,最后每孔取250 μ L液体依次加入96孔板中,将96孔板置入分光仪中,取OD值为492 nm进行半定量分析测定。5、RT-PCR定量分析提取不同实验组(Cm、Cd、Zuk、Cd+50μM indo;Cd+100μM indo;Cd+150μM indo;Cd+200μMindo;Zuk+200μM indo)中 ASCs 的 RNA。根据引物原则,测定成脂基因 PPAR-γ、CEBP-a、CEBP-β、FABP4、LPL 等,数据转换以 2-△△CT相对表达量显示,内参基因设为18S。6、脂肪移植小鼠模型本实验使用8周龄雌性C57BL/6小鼠,体重为30-40g.取35只小鼠腹股沟皮下脂肪垫,小心充分剪碎用以分离提取SVF。按Stillaert的方法提取SVF后,用PBS重悬细胞团,使最终细胞数量达到10,000个/200 μL。用1ml注射器将200μL的游离脂肪组织混合SVF/吲哚美辛或单独注射于30只受体小鼠背部两侧皮下,使两侧皮下形成一脂肪团块。因此体内实验部分可分为4组:(1)游离脂肪;(2)游离脂肪+SVF(细胞辅助的脂肪移植);(3)游离脂肪+200μMindo;(4)游离脂肪+200μMindo+SVF。移植后于2、4、12周取材观察大体及组织学染色。7、大体观测及组织学检查脂肪移植术后2、4、12周时,将小鼠麻醉后准备取材。从小鼠背部正中线作一切口,充分暴露移植术区,将移植的脂肪组织小心与周围皮肤及基底肌肉组织剥离,并用排水法测量各自体积,同时检测湿重。获取的脂肪组织用4%的福尔马林液固定过夜以备用于组织学检查。将固定后的样本用石蜡包埋,连续切片(5μm)后进行苏木精-伊红染色。8、免疫组化为鉴定样本中脂肪细胞的活性,围脂滴蛋白(perilipin)用以鉴定活性脂肪细胞。室温下分别加入一抗(兔抗鼠围脂滴蛋白rabbit anti-rat perilipin;Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)1:300 染色 1h,PBS 冲洗三次后加入二抗(抗兔 EnVision Systems anti-rabbit,Dako,Glostrup,Denmark)染色 30mim,再次洗涤后加入增色剂3,3'-Diaminobenzidine(DAB)浸染2mim。CD31(platelet endothelial cell adhesion molecule)染色用以分析移植物样本的血管化情况。同样的,切片滴入一抗(rat anti-mouse;BD Biosciences,San Jose,CA,USA)1:100的比例染色1h,PBS冲洗3遍后加入二抗(Dako rabbit anti-rat biotinylated immunoglobulin)1:200的比例染色30min。再次充分洗涤后加入过氧化物酶检测体系(ABC Elite;Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)增强染色30mim。上述染色完成后,所有切片进行苏木精复染,脱水,DPX封片处理可待镜下观察。9、活性脂肪细胞的形态测定及血管化分析本实验组使用计算机辅助立体检测系统(MBF Bioscience,Williston,VT,USA)定量分析活性脂肪细胞及血管化情况。围脂滴蛋白和CD31染色切片分别置于10×、20×放大物镜下观察。将全视野所见样本边缘描绘出来以16点网格叠加均分处理(400 μm × 400 μm),随机选择整体样本的25%进行计数统计,任意阳性染色细胞正落在随机技术点正中心时则计数,反之则不计数。最终活性脂肪细胞和CD31阳性细胞的百分比则是所得阳性计数细胞与参与统计细胞的比值X100%。以上所有计数结果均由两位统计员双盲计数所得。10、统计学处理数据均以平均数±标准误(Mean±SEM)表示。使用统计学软件SPSS 13.0进行统计学处理。两组以上的组间比较采用one-wayANOVA(Bonferroni事后两两比较)方差分析。P0.05视为有统计学差异。结果1、吲哚美辛以剂量递增的方式促进ASCs向成熟脂肪细胞分化本实验中,不同浓度的吲哚美辛均可促进hASC的成脂化过程。油红O染色用以鉴别成熟脂肪细胞的分化程度。观察发现,诱导后7天细胞形态发生明显改变,加入不同浓度吲哚美欣培养液诱导成脂时可在72h内观察到脂滴聚集。总体而言,经过2周递增浓度梯度成脂诱导培养基培养后细胞的分化成熟程度也表现出剂量递增模式,并且添加200μ indo诱导成脂培养基组脂滴最多,大致观察与Zuk诱导成脂组无异。然而,在Zuk+200μMindo(400μ indo)组富含脂滴的成熟脂肪细胞的数量并不出现持续性的增高。这一现象与半定量分析油红O溶液吸收率的结果一致。2、吲哚美辛在脂肪来源的条件培养基中上调成脂基因的表达200μM吲哚美辛联合脂肪来源的条件培养基可有效诱导成脂化过程,培养后7天成脂基因PPAR-γ,CEBP-α,FABP4,LPL的表达显著抬高,这一时期仅CEBP-β的表达并未出现明显上抬,可能原因是CEBP-β的表达量上升出现于成脂化的较晚时期而非早期。其中,PPAR-γ的表达在吲哚美欣+脂肪来源的条件培养基组与Zuk培养组有同等程度的升高,这两组表达量明显高于阴性对照组和单独添加吲哚美辛组,并与Zuk组无显著性差异。总体而言,吲哚美欣在脂肪来源的条件培养基的存在下的所有基因表达均显著提高,而单独应用该药物或单独使用脂肪来源的条件培养基并不出现成脂基因明显上台表现,提示吲哚美欣的促成脂效应只有在成脂微环境下才能得到最大化。3、移植组织的大体观察和体积测量移植物在移植早期(2周和4周)出现了良好的包裹和血管化。SVF辅助脂肪移植组和吲哚美辛辅助脂肪移植组在所有时间点与单独脂肪移植组相比体积均明显增大。12周时计算移植体积终保留率,吲哚美辛处理组(不加SVF/加SVF)的体积终保留率显著增加,分别为28.8%和35.76%,对照组为14.9%。吲哚美欣辅助脂肪移植组与SVF辅助脂肪移植组的体积终保留率无显著差异。4、吲哚美欣促进移植脂肪细胞的活性但对血管化无影响通过围脂滴蛋白鉴定脂肪细胞的活性。可以观察到,4周时,吲哚美欣处理组活性脂肪细胞的形态学表现上具有更好的组织结构的完整性。活性脂肪细胞的百分比分别为吲哚美欣处理组(62%± 1.4%)、单独脂肪移植组(对照组)(44%± 2.3%)(p=0.016),提示吲哚美欣可帮助延迟脂肪细胞的死亡或增强ASC的生存能力,这些都可促进移植晚期的成脂化过程。然而值得注意的是,吲哚美欣单独处理组(62%± 1.4%)与SVF辅助移植组(60.9%± 1.9%)(p=0.138)在脂肪体积百分比上未见明显不同。同样,CD31染色在各组之间也未见明显差异(p=0.290)。上述所有数据均由组织形态学分析定量计数4周时围脂滴蛋白和CD31的阳性比率所得,该时间点由Kato等日本学者认为是脂肪再生发生的最有效阶段,其研究亦观察到围脂滴蛋白阳性细胞在该时间点出现峰值。5、吲哚美欣处理后可提高脂肪再生的能力本实验中我们意外发现了在移植组织中的间质纤维组织和空泡周围出现了一些小而圆的单房或多房细胞,其直径一般小于30 μm并强烈表达围脂滴蛋白,这揭示了移植后的成脂化现象,且对照组和吲哚美欣处理组均在4周时达到峰值。另有研究将直径小于30 μm的小脂肪细胞定义为新生的脂肪细胞,而在我们的研究中,这一现象通常在2周和4周是可以观察到,与此同时在对照组中却极少观察到此类小脂肪细胞的存在。正因为该类细胞具有脂肪新生的提示性意义,我们对此类细胞进行量化,结果显示,代表着新生脂肪细胞的小脂肪细胞的数量在吲哚美欣处理组要明显高于对照组,然后该类细胞的数量在两组中均在12周时降低到较低水平,预示着脂肪再生的过程减缓。讨论本研究原创性的特征是在不需额外添加SVF的情况下首次将吲哚美欣辅助用于脂肪移植中,在移植物体积和活性脂肪细胞的百分比上都与细胞辅助的脂肪游离移植组效果类似。无论是否添加SVF,吲哚美欣处理组在最终体积保留率上都明显优于对照组。多项研究表明,SVF辅助的脂肪游离移植能够有效提高移植脂肪的最终体积,这可能是由于其增加了宿主来源的脂肪新生和血管化。然而,这项技术在标准化操作程序的安全性问题依然存有很大争议。另外,SVF的表型的复杂性也使得其投入标准化使用更加困难,因此,寻找更简便的方法最大化脂肪移植的终保留率将具有临床吸引力。我们的体外实验研究提供了一个从更层次探讨药物与ASCs相互作用机制的理解。首先,我们证实了吲哚美欣可以通过上调成脂基因激活成脂化过程。这也同时得到了 Styner等学者的支持,他们的研究发现,吲哚美欣是通过上调PPARγ2的表达可激活并启动前脂肪细胞和骨髓来源的MSC的成脂过程。具体来说,吲哚美欣作为PPARγ的配体促进了关键性成脂基因靶向的转录调控。吲哚美欣同时又是非甾体消炎药和环氧合酶2(COX2)抑制剂,可能通过抑制环氧合酶2的代谢产物——前列腺素2(PGE2)来阻断Wnt信号通路,同时阻止成脂转录过程中的下游效应分子β连环蛋白的聚集。还有学者发现吲哚美欣与包裹性的水凝胶材料混合移植内可以调节移植物的局部微环境并减轻促炎性细胞因子诱导的凋亡过程,因而提高并保护了移植材料内MSC的活性。这在移植早期非常重要,此时期移植的脂肪在等待重新建立血管系统时受到宿主免疫系统的伤害。值得一提的是,通过局部施加抗炎药物吲哚美欣模拟宿主免疫反应来提高整体移植脂肪的稳定性可能会是一个可行策略。我们已经证实吲哚美欣的促成脂效应是以剂量递增方式表现的,根据我们的体外实验选定了 200 μM的浓度作为体内实验的参考最适宜浓度。然而,由于大部分报道都是关于吲哚美欣口服剂量或主要聚焦于体外研究,至今仍缺乏关于吲哚美欣用于皮下注射的相关体内研究。根据我们的研究,目前临床初级方案仍是以注射时即单剂量联合使用更为推荐。尽管连续口服吲哚美欣已被多数人耐受,但药物辅助的脂肪移植技术较之细胞辅助的脂肪移植作为一种弥补或补充手段,其优势和局限性在临床应用时仍需进一步评估。结论1、吲哚美欣的体外促成脂效应呈剂量递增表现2、吲哚美欣可促进移植脂肪细胞的活性即提高移植组织的最终保留率,但对血管化无明显影响3、吲哚美欣通过上调pPARγ等多项成脂基因的表达,并调控移植物局部炎症及炎症因子诱导的凋亡过程改善局部微环境来提高移植效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R622

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