调节性T细胞改善缺氧诱导的小鼠肺动脉高压的实验研究

发布时间：2018-08-04 10:41

【摘要】：1背景肺动脉高压(PAH)是一种严重威胁人类健康的疾病,它常伴有多种肺脏和心脏的疾病而导致发病率和死亡率增加,目前仍没有有效的治疗方法。PAH的发病机制十分复杂,目前我们仍不清其具体的发病机制。报道发现在PAH的发病过程中常常伴有血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及炎症细胞增生和聚集。血管平滑肌细胞(VSMC)具有多种细胞表型,存在于血管的中间层,正常情况下处于静息状态,以维持血管的紧张度。当处于病理条件下,有些VSMC就转变成“合成型”,分泌炎性细胞因子从而导致血管发生病理改变。当前认为,肺动脉进展性的重塑是造成肺动脉高压肺动脉难以治疗的主要原因,而VSMC的增生则是造成肺动脉重塑的一个重要因素。近年来,免疫机制在肺动脉高压的发病机制中受到越来越多的关注,但是免疫调节机制是如何促进肺动脉高压发病的机制仍不清楚。CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)是一组特殊的T细胞亚群,它的主要作用是调控免疫反应,控制免疫反应的进展,如果Tregs数量减少或功能异常则会导致免疫紊乱。Tregs已经被证实在很多疾病中具有有效的治疗效果,但是其在肺动脉高压的治疗作用仍不清楚。此研究主要就是研究Tregs是否能影响肺动脉高压发病并探讨其中的作用机制。2目的(1)在体内试验中,观察Tregs对小鼠肺动脉的炎症反应和血管重塑的影响；(2)在体外试验中,探讨Tregs抑制平滑肌细胞增生的机制。3方法3.1动物模型8周龄的60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为常氧组、对照组和Tregs组,每组20只。对照组和Tregs组在含氧的10%低氧箱中喂养,常氧组与对照组和Tregs组均在同一个房间中喂养4周。所有的小鼠食物和水源都是一致的,实验第4周后安乐处死。3.2分选和转移分离8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾细胞,利用磁珠分选技术获得纯化的TregS。纯化的Tregs按要求分别溶于200 u 1 CD4+CD25+ regulatory T PBS中。小鼠在放入低氧箱前一天,Tregs组小鼠通过小鼠尾静脉注入Tregs (106 cells),对照组小鼠注入PBS。3.3血流动力学检测将小鼠麻醉,仰卧位固定于手术台上,使用小鼠气管插管。使用26号测量管经剑突下途径经皮穿至胸腔,通过其末端链接的压力传感器测量并记录右心室收缩压(RVSP)数据。整个过程中,小鼠可自然呼吸,并且其心率均维持在300-600次／分。小鼠处死后,将小鼠左心室与室间隔作为一个整体与右心室剥离,并分别测量其质量,以计算Fulton's旨数。3.4体重及血脂实验的0周和4周末,分别测量每组小鼠的体重。4周末检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。3.5细胞培养利用磁珠分选将Tregs细胞从健康人群外周血单核细胞中游离。将人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)在含有小牛血清的DMEM培养液中传至第四代,放在低氧条件下培养(1% O2,5% CO2), 分为对照组和Tregs组。Tregs组加入Tregs (5 ×105/well)共培养,对照组不加入T细胞,二者均加入抗-CD3抗体(50ng/ml)在37°C培养48小时。3.6 hPASMC的增值测定使用MTT法测定hPASMCs增值。在96孔板中以每孔5000个细胞的密度种植,在放置缺氧条件前加入或不加入Tregs,在10 μL MTT (5mg/mL)/孔37℃条件下孵育4小时。去掉上清液后,加入DMSO75 μL/孔。使用全波长多功能扫描仪以570 nm波长分析样本。使用6孔板以相同的密度种植hPASMCs,并在上述条件下进行处理。使用结束时使用PBS冲洗,胰酶处理,使用血细胞计数器进行细胞计数。3.7 RT-PCR搜集小鼠的肺或肺动脉平滑肌细胞,提取RNA,测量肺Foxp3,MCP-1,IL-1β, IL-6, IL-10以及肺动脉平滑肌细胞cyclin Dl, CDK4, p27, Akt及ERK mRNA的表达。3.8 Western blot搜集小鼠的肺或肺动脉平滑肌细胞,提取蛋白,测量肺Foxp3, MCP-1, IL-1 β, IL-6, IL-10以及肺动脉平滑肌细胞cyclin Dl, CDK4, p27, Akt及ERK蛋白的表达。4结果4.1动物一般情况各组小鼠体重以及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无显著统计学差异。4.2 Tregs增加了Foxp3的表达Foxp3在Tregs特异性的表达,是Tregs的分化成熟和起效的必要性的标志。此实验发现经小鼠尾静脉注入Tregs的小鼠肺脏中,Foxp3 mRNA的表达明显高于对照组。此结果证实外源性Tregs可以进入到小鼠的组织中。4.3 Tregs可降低缺氧诱导升高的肺动脉压和右心室的肥厚右心室收缩压(RVSP)与肺动脉压(PAP)有绝对的正向关系。相对于常氧组小鼠,低氧条件下小鼠的RVSP是升高的。使用Tregs处理的小鼠其RVSP明显降低。慢性缺氧可以导致右心室的肥厚,我们在这个研究中测量了Fulton's指数,结果显示缺氧条件下可伴有Fulton's指数的增加,而在Tregs组其Fulton's指数在部分程度上得以降低。此结果表明Tregs可以改善缺氧诱导的肺动脉压力和右心室肥厚。4.4 Tregs可以下调炎症因子的表达,上调抑炎因子的表达。在小鼠肺组织中,我们通过RT-PCR方法,发现Tregs组促炎性因子MCP-1,IL-1 β和IL-6的表达明显低于对照组。MCP-1, IL-1β和IL-6的蛋白表达水平也是相似的结果。此外我们也发现抗炎性介质IL-10在Tregs组明显高压对照组。这些结果表明Tregs可以降低促炎性细胞因子的表达而上调抗炎性细胞因子的表达。4.5 Tregs可减少缺氧造成的hPASMCs的增生。我们通过MTT方法发现相对于缺氧组,Tregs可以抑制HPASMCs的增生。细胞计数分析也得到了相似的结论。我们认为Tregs对HPASMC的抑制作用是减缓肺动脉高压进展的重要机制。4.6Tregs促使缺氧的hPASMCs停留在G1/G0期细胞的增值依赖于由G1/G0期转到G2/S期。此实验发现,通过Tregs处理的HPASMCs,与对照组相比,有更大比率的细胞处在G1/G0期。4.7 Tregs可减少cyclin D1和CDK4表达,增加p27的表达。cyclin D1, CDK4和p27在细胞增值及细胞周期中起到关键的作用。我们发现在体外实验的HPASMCs中,cyclin D1, CDK4的mRNA和其蛋白表达水平都较Tregs组的明显降低,而在Tregs处理的HPASMCs中,其p27的mRNA蛋白表达都明显高于对照组。这个结果表明Tregs通过调节细胞周期的方式是减缓肺动脉高压发病发展的另外一个机制。4.8 Tregs降低Akt和ERK1/2磷酸化水平。已经有报道,Akt和ERK是肺动脉平滑肌细胞增生的主要途径之一。我们通过western blo方法检测体外的HPASMCs表达的Akt和ERK蛋白水平。我们发现,相对于对照组,Tregs可以明显下调Akt和ERK蛋白的磷酸化水平。5结论(1) Tregs可以缓解缺氧诱导的肺动脉高压的形成；(2)其主要的机制是Tregs可以明显抑制炎症反应,增强抗炎性反应,调整细胞增值周期,抑制hPASMCs的增生；(3) Tregs可能成为治疗肺动脉高压的一个有效的方法。1背景:肺动脉高压(PA战不仅仅是一种疾病,而是一系列的疾病的统称,它严重威胁着人类健康,其发病机制仍不清楚。它共有的特征是复杂的血管内皮的增生和持续进展的肺血管的重塑,血管的平滑肌细胞增生在血管重塑过程中起到不可或缺的作用。缺氧性肺动脉高压是肺高压的一种重要的临床亚型,我们常见的慢性阻塞性肺疾病及肺间质纤维化常常伴有缺氧性肺动脉高压,其中有报道慢阻肺急性加重的病人中有91%伴有肺高压,它可进一步导致右屯、室肥厚甚至右也室衰减,这直接决定了病人的预后。目前对肺高压仍没有肯定的治疗方法。精氨酸酶(Argnase Arg)是作用于尿素循环的酶,可W将精氨酸转化成尿素和鸟氨酸,精氨酸酶2(Arg2)主要在肾脏、血管平滑肌细胞的线粒体基质内,它是缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增生有关的特异性精氨酸酶亚型。近来,越来越多的研究发现在缺氧性肺动脉离压中,精氨酸的表达明显X椉，

本文编号：2163685