MCM7和CD147在大鼠TBI中的相互作用及其机制的实验研究

发布时间：2018-08-16 10:30

【摘要】：研究背景：创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是一种日益增多的公共卫生问题,涉及到巨大的社会成本,是全世界致残率和致死率最主要的病因,尤其是儿童和青少年。TBI是一个渐进性的病理生理过程紊乱事件。最初,受伤当时的机械力损伤,可以导致神经元、轴索、胶质细胞和血管的直接机械性损伤。在原发性损伤后立即启动一系列连续性复杂的病理生理过程,触发大量的继发性损伤级联反应,最终导致渐进性组织损伤和细胞死亡,又称继发性损伤。继发性损伤在创伤后数秒到数分钟内启动,可持续到数月或数年。继发性损伤是TBI后神经退行性变和神经功能障碍的最重要的原因。一个重要的迟发性损伤机制涉及到细胞周期激活(cell cycle activation,CCA),导致成熟的神经元和/或少突胶质细胞的凋亡,以及小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。研究表明,在TBI后,在脑组织中可检测到细胞周期活化标记物的表达明显增高,如Cyclin D1, CDK4, E2F5, c-myc,和PCNA。 MCMs是DNA复制过程中必不可少的重要物质,是启动细胞周期S期的许可成分,并且能够进一步使DNA从复制叉中的超螺旋状态发挥微弱的解链酶作用。MCM7是高度保守的微小染色体维持蛋白家族成员之一,对于基因组复制的启动是必须的。MCM7cDNA编码一个543个氨基酸蛋白,在所有组织中均有表达。CD147,或细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)是一种跨膜糖蛋白,也称为Basigin(BSG),是由Basigin基因编码。CD147是免疫球蛋白超级家族成员,主要组成了两个细胞外免疫球蛋白域(C和V)。CD147在许多组织和细胞中表达,最先被发现存在于实体瘤细胞表面。CD147通过自主分泌和旁分泌方式刺激产生MMPs。在病理生理情况下,MMPs以蛋白水解的形式降解各种ECM中的成分和BBB的紧密连接蛋白,引起BBB破坏。基于上述资料,似乎MCM7和CD147可能涉及到TBI后的病理生理和生物化学过程,然而,在TBI中MCM7和CD147的表达和可能的作用尚未明确。我们本实验的目的是想通过研MCM7和CD147的表达及其相互作用,来进一步明确MCM7、CD147与脑损伤后神经病理性改变的关系。第一部分MCM7在大鼠TBI中的表达变化及其作用机制的实验研究微小染色体维持蛋白(Minichromosome maintenance protein, MCM)家族是DNA复制的调节器,确保复制的发生在一个细胞周期内只复制一次。MCM蛋白是DNA复制过程中必不可少的重要物质,是启动细胞周期S期的许可成分,能够进一步使DNA从复制叉中的超螺旋状态发挥微弱的解链酶作用。MCM7是MCM家族中的一个成员,它的互补DNA (cDNA)编码一个543个氨基酸蛋白,在所有的组织中广泛表达。MCM7不但参与DNA复制过程,而且与MYCN转录因子相互作用,调节自己的转录。以前的研究已经证实,MCM7与CDK4有关,能够直接与RB相互作用,参与DNA复制中细胞周期的控制。RB基因产物是控制细胞周期从G1到S期过渡的最重要的调节因子之一。最近的研究表明,位于MCM7基因内的miR106b簇能够随着CDK4/6以E2F和RB依赖性的模式抑制而有效地被抑制。基于上述资料,似乎MCM7可能涉及到TBI后的病理生理和生物化学过程,然而,在TBI中MCM7的表达和可能的作用尚未明确。在目前的研究中,我们首次研究了成年大鼠TBI模型损伤后MCM7的时间和空间上的表达模式,首次实验验证了MCM7的表达与CNS神经病理性疾病的关系。目的与方法通过建立成年鼠的TBI模型来研究MCM7在大鼠TBI后的表达的变化规律,并在细胞水平探讨MCM7的功能及其在中枢神经系统病变和修复中的细胞和分子机制中的作用获得更深的理解。健康雄性的S-D大鼠,随机分为正常组、假手术组和手术组。手术组在右侧皮层正中线旁开3mm处层做一个前后轴向外科切口。假手术组麻醉和外科准备后,只打开颅骨,而不进行皮层损伤。采用Western blot法检测脑创伤后组织中的MCM7、PCNA及Caspase-3的表达。利用免疫组织化学法对MCM7在大鼠脑组织中的表达变化。然后通过双免疫荧光标记法,进一步验证MCM7在创伤性脑损伤中的空间表达特征。结果1、大鼠创伤性脑损伤后,Western blot法MCM7在脑皮层组织中的表达变化蛋白免疫印迹法显示在损伤周围大脑皮层中,在正常和假手术组的皮层中MCM7的表达水平相对较低。但是在TBI损伤后12小时,损伤周围大脑皮层中MCM7的表达逐渐增加,在第3天达到高峰,随后逐渐下降,在TBI后第28天,MCM7的表达恢复到基线正常水平。而在正常组和假手术组中,MCM7的表达水平没有任何变化。这些资料提示MCM7蛋白的表达水平在TBI后发生了时间上的变化。2、大鼠创伤性脑损伤后,免疫组织化学法MCM7在脑皮层组织中的表达变化结果显示,在损伤病灶的周围的皮层脑组织细胞的胞浆内MCM明显增多。然而,在对侧半球的同侧部位和未受损伤的假手术组中的脑组织中阳性染色较少。进一步放大倍数清晰地显示,阳性染色的分布和形态学变化。结果显示,在创伤性脑损伤后3天,在同侧受损的脑组织皮层中MCM7的表达明显高于损伤对侧半球和假手术组。定量分析显示,创伤性脑损伤3天后在对侧和同侧中,每平方毫米MCM7阳性细胞数在损伤侧大脑皮层中MCM7表达明显增高。3、大鼠创伤性脑损伤后,双免疫荧光标记法MCM7与损伤后不同特异性标记物表型的共定位我们发现,MCM7在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞中均广泛表达。有趣的是,同假手术组相比,MCM7在受损的神经元和胶质细胞中的亚细胞定位是变化的。MCM7出现在假手术组脑组织中的神经元的神经核、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞中。然而,在创伤3天后,MCM7在受损脑组织的神经核和胞浆内有表达。结合上述资料实验资料结果,我们推测MCM7可能参与了TBI后细胞周期的调控从而参与了神经元的凋亡和星形胶质细胞的增殖等生物学行为。4、大鼠创伤性脑损伤后,在创伤性脑组织中活性Capase-3和MCM7的免疫活性关系我们采用Western blotting法检测活性caspase-3的表达特点,结果发现在创伤后12h活性caspase-3开始逐渐升高,在TBI后3天达到高峰,在28天逐渐下降到基线水平。而我们的实验结果证实,在TBI后MCM7的表达水平有时间特征性的变化,与活性caspase-3表达水平相比具有一致性。由此可以推测MCM7的表达与凋亡具有一定的相关性。为了进一步验证MCM7与神经元凋亡的关系,我们采用免疫荧光标记法检测是否NeuN/活性caspase-3,以及活性caspase-3/MCM7间存在共定位关系。在TBI后第三天,我们观察到NeuN/活性caspase-3,以及活性caspase-3/MCM7间存在共定位关系。这些结果说明,MCM7和活性caspase-3的变化与颅脑损伤后的变化具有相关性。由此,可以推测MCM7可能通过影响活性caspase-3的表达而参与了创伤性颅脑损伤后神经元的凋亡过程。5、大鼠创伤性脑损伤后,MCM7与成人大鼠脑组织中细胞增殖的关系为了进一步验证MCM7是否参与了TBI的细胞周期激活,我们通过Western blotting法首先检测了PCNA的表达。结果显示在TBI发生后,PCNA的蛋白表达水平增高,而且与MCM7的表达水平在时间依赖性模式是一致的。随后,我们对TBI后3天的脑组织内PCNA和NeuN、GFAP、CDllb和MCM7进行了双标记免疫荧光染色法检测。在NeuN, GFAP,以及CD11b中检测到MCM7/PCNA的共定位关系。这些结果证实了我们的推测,即MCM7可能通过细胞周期重新进入的信号通路参与了神经元的凋亡和胶质细胞的增殖反应。结论1、MCM7在大鼠创伤性颅脑损伤后的表达具有时间和空间的特征性变化规律：MCM7在颅脑损伤12小时后其表达水平逐渐升高,在3天时达到高峰,随后逐渐下降,并在28天恢复至正常水平。2、MCM7在大鼠受损的脑皮层组织中MCM7在受损脑组织的神经核和胞浆内有表达。3、MCM7在蛋白水平的表达具有特征性变化,这种变化和caspase-3的变化具有一致性。提示MCM7在脑外伤后神经元细胞的凋亡方面具有一定作用,它具有促凋亡的生物学特性。4、MCM7在蛋白表达水平有特征性变化,这种变化及PCNA的变化具有一致性。提示MCM7可能参与了大鼠创伤性脑损伤后胶质细胞的增殖。5、大鼠创伤性脑损伤后的分子生物学变化与MCM7的生物学活性具有相关性。6、MCM7在大鼠脑外伤后受损的皮层中有特定的时间和空间表达模式。提示MCM7可以作为神经元损伤的重要的生物标记物。第二部分 MCM7和CD147在大鼠TBI中的相互作用及其作用机制的实验研究细胞周期的精确调节对于许多的细胞过程至关重要,如增殖、分化、凋亡和癌变。在某些病理情况下,细胞周期激活机制影响成人中枢神经系统的正常功能,也参与了急性和慢性神经变形性疾病的病理生理过程。基质金属蛋白酶是一组锌依赖性肽链内切酶,在动物体内的生理和病理中具有多方面功能,主要参与细胞外基质(ECM)的降解。MMPs在正常生长、发育、伤口愈合、血管生成、神经发生、骨骼重构、排卵和移植方面起到明显作用。然而,在病理生理情况下MMPs引起BBB破坏、出血、神经炎症和细胞死亡。CD147,或细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)是一种跨膜糖蛋白,是由Basigin基因编码。CD147是免疫球蛋白超级家族成员,主要组成了两个细胞外免疫球蛋白域(C和V)。我们前面的研究中,我们首次研究了成年大鼠TBI损伤后MCM7的时间和空间上的表达模式,首次实验验证了MCM7的表达与CNS神经病理性疾病的关系。但是对于MCM7是如何发挥作用的仍未明确,同时MCM7在脑创伤中是否参与了脑损伤后细胞周期的改变仍未明确。目的与方法我们通过建立成年鼠的TBI模型,来研究CD147在大鼠脑损伤后的表达的变化规律,并通过研究MCM7和CD147的相互作用,来进一步明确MCM7与脑损伤后神经病理性改变的关系。健康雄性的S-D大鼠,随机分为正常组、假手术组和手术组。手术组在右侧皮层正中线旁开3mm处层做一个前后轴向外科切口。假手术组麻醉和外科准备后,只打开颅骨,而不进行皮层损伤。采用Western blot法检测脑创伤后组织中的CD147的时间的表达变化。利用免疫组织化学法监测CD147在大鼠脑组织中空间表达变化。然后通过双免疫荧光标记染色显微镜法检测CD147在皮层组织中的定位情况。结果1、大鼠创伤性脑损伤后,CD147在脑皮层组织中的表达变化蛋白免疫印迹显示在损伤周围大脑皮层中,在正常和假手术组的皮层中CD147的表达水平相对较低。但是在TBI损伤后12小时,损伤周围大脑皮层中CD147的表达逐渐增加,在第3天达到高峰,随后逐渐下降,在TBI后第28天,CD147的表达恢复到基线正常水平。而在正常组和假手术组中,CD147的表达水平没有任何变化。这些资料提示CD147蛋白的表达水平在TBI后发生了时间上的变化(temporally change)。这种改变与MCM7的在颅脑损伤后的改变是一致的。说明这两者可能存在一定的相互作用。2、大鼠创伤性脑损伤后,免疫组织化学法CD147在脑皮层组织中的表达变化我们选择在TBI后3天作为免疫组织化学法染色的时间截点,因此时CD147的表达达到高峰值。结果显示,在损伤病灶的周围的皮层脑组织细胞的胞浆内CD147明显浓聚。然而,在对侧半球的同侧部位和未受损伤的假手术组中的脑组织中阳性染色较少。进一步放大倍数清晰地显示,阳性染色的分布和形态学变化。结果显示,在创伤性脑损伤后3天,在同侧受损的脑组织皮层中CD147的表达明显高于损伤对侧半球和假手术组。定量分析显示,创伤性脑损伤3天后在对侧和同侧中,每平方毫米CD147阳性细胞数在同侧大脑皮层中MCM7表达明显增高。3、大鼠创伤性脑损伤后,双免疫荧光标记染色法显示CD147在脑皮层组织中的表达变化我们发现,CD147在神经元、星形胶质细胞中均广泛表达。有趣的是,我们观察到,同假手术组相比,CD147在受损的神经元和胶质细胞中的亚细胞定位是变化的。CD147出现在假手术组脑组织中的神经元的神经核、星形胶质细胞中。然而,在创伤3天后,CD147在受损脑组织的神经核和胞浆内有表达。这种变化与MCM7的变化出奇的一致。结合上述资料实验资料结果,我们推测MCM7可能通过CD147参与了TBI后神经元细胞周期的调控和胶质细胞的增殖等生物学行为。4、大鼠创伤性脑损伤后,在创伤性脑组织中活性CD147和MCM7的免疫活性关系为了进一步验证MCM7的表达与CD147的关系,我们采用免疫荧光标记法检测是否CD147/MCM7间存在共定位关系。在TBI后第三天,我们观察到CD147/MCM7间存在共定位关系。这些结果说明,MCM7和CD147的变化与颅脑损伤后的变化具有相关性。为了进一步确定两者之间的关系,我们采用免疫共沉淀的方法研究两者之间的关系,结果发现两者存在免疫共性。由此,可以推测MCM7可能通过影响CD147的表达而参与了创伤性颅脑损伤后细胞周期过程。结论1、CD147在大鼠创伤性颅脑损伤后的表达具有时间和空间的特征性变化规律：与MCM7的表达变化具有一致性。2、MCM7与CD147在脑损伤后神经元及星形胶质细胞中表达变化一致。3、MCM7与CD147可能共同参与了脑损伤后神经元的凋亡及星形胶质细胞的增殖,可以为TBI的治疗提供新的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.15
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本文编号：2185713