液质联用技术在两种中药成分分析中的应用

发布时间：2018-08-31 11:04

【摘要】：目的：中药化学成分和体内吸收代谢成分是中药发挥药效作用的物质基础。随着液相色谱与质谱联用技术的不断进步,对中药化学成分和体内吸收代谢成分进行定性与定量分析已成分中药药效物质基础研究的重要手段之一。本论文以两味常见中药何首乌和附子为研究对象,采用超高压液相与线性离子阱轨道离子阱组合高分辨质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap)联用技术系统分析附子和何首乌中的天然活性(毒性)成分。深入研究何首乌代表性成分二苯乙烯苷、蒽醌类等,附子代表性成分二萜类生物碱成分的高分辨多级质谱裂解规律。在此基础上开展何首乌药材定量方法研究、大鼠体内代谢轮廓研究和大鼠体内药代动力学研究,为中药物质基础和中药现代化研究探索新的可行的方法和技术。方法：1、运用LTQ-Orbitrap高分辨多级质谱技术系统研究何首乌主要成分二苯乙烯苷的质谱裂解规律。方法为以何首乌代表性成分二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素等作为模式成分,采用直接持续进样方式,进样速度为8μ L/min。质谱全扫描范围为m/z 150-1500,高分辨全扫描分辨率设为30000(以m/z 400的半峰宽计),MS2-MS3采用Orbitrap高分辨扫描,扫描分辨率设为15000,MS4以后的子离子采用用LTQ打拿极(dynote)检测。选择上一级最高峰进行下级碎裂扫描,碎裂方式为碰撞诱导解离(CID)方式,其碰撞能量为35%。2、建立基于何首乌及相关药材的化学成分质谱数据库,并运用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技术,结合模式成分的质谱裂解规律,对何首乌药材化学成分进行分析。液相条件为：色谱柱采用Thermo Hypersil Gold C18 column (2.1 × 100 mm,1.8 μm),流动相由乙腈(A)和含0.1%甲酸水(B)两相组成,其洗脱梯度为：5% A(0min); 15%　A (6min),15%　A(12min); 38%　A(25min); 70%　A (30 min)和 90% A (35min)。流速为300μL/min。在线DAD检测200-400 nm范围光谱。质谱条件为：通过电喷雾离子源(ESI)与液相部分连接,分别采用正、负离子检测模式各采集一次,扫描范围为m/z 150-1500,离子源所用气体为氮气。一级全扫描采用高分辨设置,其分辨率设置为30000,二级质谱高分辨全扫描分辨率设为15000,三级质谱高分辨全扫描设置为7500。多级扫描采用数据依赖性扫描(data-dependent MSn scanning),选取上一级最高丰度母离子进行碎裂并进行动态排除设置(dynamics exclusion)。3、运用液相与离子阱质谱联用技术建立快速测定何首乌4种代表性成分大黄素、大黄素-8-O-葡萄糖苷、没食子酸和二苯乙烯苷含量的方法,并对20批不同产地、不同炮制来源的中药何首乌饮片进行检测。采用Thermo fisher Accela UHPLC超高压色谱系统。色谱柱为Waters UPLC BEH C18柱(2.1mm×50 mm,1.7μm)。流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水系统组成,梯度洗脱。系统程序为：13% A(0 min),35% bA(3.5 min), 90% A(7.5 min),95％A(8.5 min)和95% A(10 min),每次进样前以初速流动相平衡4 min.流速为400μL/m in。柱温为室温。进样量为5 μL。在线DAD检测记录200-400nm光谱数据。质谱方法采用LTQ-Orbitrap高分辨多级质谱联用仪并通过ESI接口与液相部分相连。定性检测采用子离子全扫描模式,通过对比保留时间、碎片离子丰度、碎片离子高分辨质谱数据用于定性检测。定量采用SRM的方法,即选择目标成分的母离子在离子阱内进行二级反应监测,选择最高响应子离子进行监测。其离子对选择如下：gallic acid:m/z 169→125；emodin:m/z 269→225；THSG:m/z 405→243; Emodin-8-glu:m/z 431→269.4、应用UHPLC-LTQ-Orbitrap技术系统研究何首乌在大鼠血液和尿液的代谢轮廓,利用相关文献数据、诊断离子搜寻策略及高分辨多级质谱信息从大鼠血液和尿液样品中推测体内成分。方法为：SD大鼠分尿液组、血液组和空白组。大鼠代谢笼适应性饲养一周,间隔1.5 h灌胃2次首乌提取液,每次剂量为2 mL/kg,空白组给予相应剂量生理盐水。其中尿液组大鼠按第一次给药时间计收集0.5 h-3 h尿液。血液组第二次给药后间隔0.5 h眼眶静脉采血,采血前10%水合氯醛麻醉,采血3次,分别为第二次给药后30 min、1h、1.5 h.同时收集空白组尿液和血样。所得血样经低速离心(5000rpm,10 min),取上层血浆,-80℃保存。血浆样品经有机溶剂沉淀法处理,尿液样品经甲醇蛋白沉淀,取上清液,浓缩至2 mL,加入2 mL乙腈-甲醇混合试剂(3：1),漩涡5 min,高速离心(15000 rpm,10 min)。取上清液,即得.液相部分采用Thermno-Fisher Accela UHPLC色谱系统。色谱柱为Phemomenex Kinetex C18(2.1×100mm ,2.6μm).流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水系统组成,梯度洗脱。系统程序为：5% A(0 min),35% A(13.5 min),60% A(23.5 min),90% A(30 min),每次进样前以初速流动相平衡4 mmin。流速为200μL/min。柱温为室温。进样量为5μL。在线DAD检测记录200-400 nm光谱数据。质谱部分采用LTQ-Orbitrap高分辨多级质谱仪并通过ESI接口与液相部分相连,同前法采集质谱数据进行分析。5、采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS对大鼠灌胃何首乌二苯乙烯苷和大黄素血药浓度和药代动力学进行了初步研究。SD大鼠SPF级动物房室温环境下适应性饲养一周。按1 mL/100g剂量分别灌胃给予生首乌,另取空白组给予相应剂量生理盐水用于采集空白血浆。并于给药后5、10、15、20、30、45、60、120、240、480 min大鼠眼眶静脉丛取血750 gL至1.5 mL EP管内。所得血样于3h内经4℃低速离心(5000rpm,10min),取上层血浆,-80℃保存。色谱柱采用Waters UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm).流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水系统组成,梯度洗脱。系统程序为：8% A(0 min).30% A(3.5 min).85% A (7.5 min)、90%　A (8.5 min)、90% A (10 min)。流速为400 μL/min。柱温为室温。进样量为5μL。质谱定性检测采用子离子高分辨全扫描模式,即选择待测标准品二苯乙烯苷、大黄素和内标物虎杖苷、白藜芦醇的精确母离子m/z405、269、389、227进行二级质谱高分辨全扫描,通过对比保留时间、碎片离子丰度、碎片离子高分辨质谱数据用于定性检测。定量检测采用Orbitrap高分辨选择离子监测模式(HR-SIM)。6、系统研究了附子代表性生物碱成分在UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn碎裂行为。方法为：采用直接持续进样方式,进样速度为3μL/min。质谱全扫描范围为m/z150-1500,高分辨全扫描分辨率设为30000(以m/z 400的半峰宽计),MS2-MS3采用Orbitrap高分辨扫描,扫描分辨率设为15000,MS4以后的子离子采用LTQ打拿极(dynote)检测。选择上一级最高峰进行下级碎裂扫描,碎裂方式为碰撞诱导解离(CID)方式,其碰撞能量为40%,选择峰宽范围为m/z±1,其他参数为默认。以特征离子信号和多级质谱数据为基础,辅以高分辨质谱数据并结合文献证实,推测代表性附子生物碱在正离子模式下可能的裂解规律。7、使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技术对中药附子化学成分进行了定性分析,利用模式成分的裂解规律,自建的二萜类生物碱质谱数据库并结合文献,建立了系统鉴定流程和策略,用于附子生物碱未知成分的检测。结果：1、运用LTQ-Orbitrap高分辨多级质谱技术系统研究了何首乌主要成分二苯乙烯苷的质谱裂解规律。对其关键的离子碎裂位置进行了分析与模拟,高分辨质谱证实m/z225、215、137子离子均源于A环的内部碎裂形成的碎片,而m/z 149源于链接A、B环的烯键重排碎裂形成。这些关键的裂解途径为从何首乌中寻找相似成分提供依据。运用LTQ-Orbitrap高分辨多级质谱技术比较了几种不同取代蒽醌类成分的特征碎裂模式,对形成的多个奇电子离子进行了归属。首次全面分析了儿茶素和表儿茶素在LTQ-Orbitrap质谱中的裂解行为,为研究何首乌相关鞣质及儿茶素衍生物的定性检测提供依据。2、建立了基于何首乌及相关药材的化学成分质谱数据库,并运用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技术,结合模式成分的质谱裂解规律,对何首乌药材化学成分进行分析,共鉴定或推测87个成分,包括15个二苯乙烯类成分、19个蒽醌类成分、13个鞣质或没食子酸衍生物、6个萘类成分等。首次从何首乌中发现28个新的蒽醌二聚体糖苷成分(二蒽酮苷),运用高分辨质谱技术证实了何首乌中二蒽酮糖苷成分为emodin (10→10') emodin或emodin (10→10') physcion的母核。研究发现该类成分在ESI软电离及CID碎裂下通过10-10’均裂形成特征性的奇电子离子,这是首次从何首乌中发现有大量二蒽酮成分的存在。3、纵观国内外文献,创新性地运用液相与离子阱质谱联用技术快速测定何首乌4种代表性成分大黄素、大黄素-8-O-葡萄糖苷、没食子酸和二苯乙烯苷含量的方法,并运用于20批不同产地、不同炮制来源的中药何首乌饮片的检测,结果表明线性离子阱质谱用于定量方法开发具有快速灵敏的优点,可用于何首乌及其相关制品的质量控制：研究结果表明不同产地首乌指标性成分含量差异巨大,炮制后何首乌的多个指标成分含量明显降低。4、首次应用UHPLC-LTQ-Orbitrap技术系统研究何首乌在大鼠血液和尿液的代谢轮廓,利用相关文献数据、诊断离子搜寻策略及高分辨多级质谱信息从大鼠血液和尿液样品中推测了45个体内成分。包括5个原形成分和40个代谢成分。结果表明大鼠灌胃何首乌代谢成分以大黄素、二苯乙烯苷、大黄素甲醚的葡萄糖醛酸和硫酸酯化的二相代谢产物为主,此外还检测到大黄素氧化与甲基化、二苯乙烯苷糖苷键水解和烯键的还原的一相代谢产物。5、采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS对大鼠灌胃何首乌二苯乙烯苷和大黄素血药浓度和药代动力学进行了初步研究。创新性地采用超高分辨SIM模式建立了二苯乙烯苷和大黄素的体内定量检测方法,结果表明Orbitrap高分辨SIM模式具有去干扰能力强、检测灵敏度高、快速简便的优点,通过LTQ-Orbitrap定性结合定量研究中药复杂体系的药代动力学和系统描绘中药体内代谢轮廓具有一定的优势。6、系统研究了附子代表性生物碱成分在UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn碎裂行为。以特征离子信号和多级质谱数据为基础,辅以高分辨质谱数据并结合文献证实,推测代表性附子生物碱在正离子模式下可能的裂解规律。研究发现,在二萜类生物碱C1、C3和C16等取代基位置为LTQ-Orbitrap质谱优先裂解的位点,在多级质谱中脱水与C3-OH有关,而特征性的CO中性丢失与C16位羟基重排有关,附子原碱成分的二级质谱形成的基峰可用来区分它们的C1、C3位取代模式。这些不同类型附子生物碱的特征质谱裂解规律和特征碎片离子有利于对附子未知生物碱的鉴定和结构分析。7、使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技术对中药附子化学成分进行了定性分析,利用模式成分的裂解规律,自建的二萜类生物碱质谱数据库并结合文献,建立了系统鉴定流程和策略,检出120余个附子生物碱成分,包括首次报道的MDA、LDA和ADA类成分,基本阐明了中药附子的化学物质基础,为今后的化学成分研究、指纹图谱及质量控制和物质基础研究奠定基础。结论：本文以两种常见中药何首乌和附子为对象,针对中药物质基础研究相关的中药化学成分与体内成分的定性定量方法的难点问题,采用超高压液相与高分辨多级质谱联用技术,开展中药化学物质基础、体内吸收代谢物质基础和药代动力学研究,系统揭示了何首乌、附子两味中药的化学物质基础。为中药的体内外成分的在线快速检测提供方法学借鉴。为中药现代化研究探索可行的技术和方法。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284.1;O657.63

【参考文献】