老龄加重缺血脑损伤并使七氟烷后处理保护失败：探索Bcl-2作用

发布时间：2018-10-07 19:46

【摘要】：研究背景脑卒中是世界第二大致死致残原因,由于脑供血血管阻塞造成的缺血性卒中,是最典型的卒中,并且是导致长期残疾的主要原因。众所周知,年龄是卒中的主要危险因素并对临床预后有重要影响。既往的研究报道,相比低龄动物,在高龄动物方面,缺血性卒中能够导致更早期的血脑屏障破坏、更大的梗死体积、更多神经元变性、更高的死亡率和更差的神经功能预后。但年龄相关的加重缺血脑损伤的机制仍不清楚。目前,对急性缺血性卒中可用的治疗仅限于使用溶栓剂如重组组织型纤维蛋白酶原激活剂(tPA)。尽管在建议的时间内应用tPA能够显著改善卒中的结局,但是由于出现继发性脑出血和脑水肿的风险较高,只有小于3%的缺血卒中病人接受tPA治疗。因此随着老龄人口的增多,我们迫切需要找到急性缺血卒中的替代治疗.大量研究表明在缺血发生之前,短时间内应用挥发性麻醉剂(称为麻醉预处理),对大脑的缺血再灌注损伤有保护作用。但是预处理需要有及时的规划,所以可能并不适于用急症的患者。作为预处理的替代手段,可以在器官再灌注后立即并短期应用挥发性麻醉药,即麻醉后处理。近期多个动物模型研究表明,应用异氟烷或七氟烷进行麻醉后处理能够改善缺血性卒中的短期神经功能和长期预后。然而,尽管遭受缺血再灌注损伤的大部分是年长者,并且大脑伴随年龄的改变很明显,但大多数对麻醉后处理诱导的神经保护研究,都是在年轻健康的动物中进行的。所以,年龄增长是否影响麻醉后处理的神经功能保护,还有待研究。因此,本研究的目的是,评价七氟烷对老龄鼠的神经保护作用,并探索脑卒中后与年龄相关的加重脑损伤的可能机制。方法两个年龄组的雄性Fisher 344大鼠(年轻鼠4个月和老龄鼠24个月),随机分为4组,每组19只。这四组分别是：(1)年轻缺血再灌注的大鼠(年轻-对照组：Y-Con):(2)年轻缺血再灌注并接受七氟烷后处理的大鼠(年轻-七氟烷组：Y-sev); (3)老龄缺血再灌注的大鼠(老龄-对照组：A-Con);(4)老龄缺血再灌注并接受七氟烷后处理的大鼠(老龄-七氟烷组：A-Sev)。用改良线栓法对大鼠的大脑中动脉阻塞2小时(h),再灌注24h,制备大鼠MCAO (middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。把接受七氟烷后处理的大鼠放在密闭动物箱中,再灌注开始后,将其立即暴露在浓度为2.6%的七氟烷中,时间15分钟(min)。对照组大鼠也被放置在同样的容器里,但容器里只有空气。在缺血再灌注后24h,用八分量表对神经功能缺损进行评分,用转棒试验对运动协调进行评价。之后,大鼠被处死取出大脑,用TTC染色来评估梗死体积,用TUNEL法来检测细胞凋亡,通过实时PCR技术来分析Bcl-2和Bax的分子表达,应用Western Blot法检测Bcl-2和Bax的蛋白质表达。为检测Bcl-2相关的抑制和促进凋亡因子基础水平的表达是否存在与年龄相关的差异,在应用MCAO法制备局灶性缺血/再灌注模型之前,随机选取年轻鼠和老龄鼠各6只,分别设定为年轻基础组(Y-Basal)和老龄基础组(A-Basal),取其大脑进行基础凋亡相关因子(Bcl-2、Bax)的分析。结果1、七氟烷后处理对梗死体积和水肿形成的影响在24 h观察期,5只年轻大鼠(3只年轻-对照组,2只年轻-七氟烷组)和7只老龄鼠(4只老龄-对照组,3只老龄-七氟烷组)死亡。尸检结果显示这12只大鼠均有严重的脑缺血和水肿。MCAO后缺血2h/再灌注24h,老龄对照组脑梗死体积明显大于年轻对照组((?)P0.05, A-Con vs Y-Con)。七氟烷麻醉后处理显著降低了年轻大鼠的脑梗死体积(*P0.05, Y-Sev vs Y-Con),约降低34%；但七氟烷后处理对老龄鼠的脑梗死体积没有显著影响。MCAO后缺血2h/再灌注24h,形成的脑水肿肿程度在年轻对照组和老龄对照组相似。相较于对照组,七氟烷后处理显著降低了年轻大鼠的水肿形成(*P0.05, Y-Sev vs Y-Con),约降低36%；然而对老龄鼠水肿并没有显著影响。2、七氟烷后处理对神经功能的影响MCAO后缺血2h/再灌注24h,老龄鼠对照组的神经评分明显高于年轻鼠对照组((?)P0.05, A-Con vs Y-Con).七氟烷后处理显著降低了年轻大鼠的神经评分(*P0.05, Y-Sev vs Y-Con),约降低33%；但对老龄鼠神经评分并无显著影响。MCAO前,4组大鼠在转棒上的停留时间无显著性差异,即神经平衡协调功能无明显差异。MCAO后缺血2h/再灌注24h,年轻大鼠对照组和老龄鼠对照组花费在旋转杆上的时间没有显著差异。七氟烷后处理显著增加了年轻大鼠停留在旋转杆上的时间(*P0.05, Y-Sev vs Y-Con),然而对老龄鼠的神经平衡协调功能却没有明显改善。3、七氟烷后处理对细胞凋亡的影响MCAO后缺血2h/再灌注24h,在大鼠的脑皮质缺血半影区观察到大量TUNEL阳性细胞,而且TUNEL阳性细胞数量在老龄鼠对照组多于年轻鼠对照组((?)P0.05,A-Con vs Y-Con)。七氟烷后处理显著降低了年轻大鼠TUNEL阳性细胞的数量(*P0.05, Y-Sev vs Y-Con),但对老龄鼠无明显改善。4、七氟烷后处理对抗凋亡和促凋亡分子及蛋白表达的影响MCAO之前,抗凋亡分子Bcl-2的mRNA和蛋白基础表达水平,老龄鼠比年轻鼠有显著的降低((?)P0.05, A-Basal vs Y-Basal)。促凋亡分子Bax的mRNA和蛋白基础表达在两组鼠中水平相似。MCAO后缺血2h/再灌注24h, Bcl-2 的 mRNA和蛋白水平,年轻对照组和老龄对照组相对于他们各自的基底表达水平都有非常显著的降低(P0.05,Y-Con vs Y-Basal, A-Con vs A-Basal)。相比于对照组,七氟烷后处理的年轻大鼠组的Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平有显著升高(*P0.05, Y-Sev vs Y-Con);但这种作用在老龄鼠组未被观测到。MCAO后缺血2h/再灌注24h, Bax 的 mRNA和蛋白水平,年轻对照组和老龄对照组相对于他们各自的基底表达水平都有非常显著的升高(P0.05, Y-Con vs Y-Basal, A-Con vs A-Basal);相对于年轻对照组,Bax的mRN A和蛋白表达水平在老龄对照组中升高的更显著(tP0.05, A-Con vs Y-Con).相对于对照组,七氟烷后处理显著降低了两组大鼠的Bax基因和蛋白的表达(*P0.05,Y-Sev vs Y-Con, A-Sev vs A-Con);然而,Bax的表达在老龄鼠组中仍然显著高于年轻大鼠组((?)P0.05, A-Sev vs Y-Sev).结论(1)老龄鼠脑内Bcl-2的基础表达降低,与脑缺血后细胞凋亡增加和脑损伤加重相关(2)老龄能够抑制七氟烷后处理诱导的脑保护(3)七氟烷后处理不能保护老龄鼠脑功能的机制之一,是无法增加Bcl-2表达来阻止脑细胞的凋亡。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614

【参考文献】