葛黄颗粒含药血清对乙醇诱导L-02细胞氧化损伤中线粒体功能的保护作用

发布时间：2018-10-17 13:15

【摘要】：目的:本实验利用乙醇诱导体外人肝细胞(L-02)损伤模型,进一步验证“葛黄颗粒”防治酒精性肝病的作用;研究其对乙醇诱导的L-02细胞氧化应激损伤中线粒体功能的保护作用,进一步阐明葛黄颗粒防治酒精性肝病的作用机制。方法:1.含药血清的制备:雄性SD大鼠60只,体重180-220g,随机分为3个组,每组20只,分别为空白对照组、葛黄颗粒组(3.1g生药/100g体重/天)、美他多辛组(0.1g/100g体重/天),每日早、晚各灌胃1次(1ml/100g/次),连续5天。末次给药前12h禁食不禁水,于末次给药后1h,2%戊巴比妥钠(0.3ml/100g)麻醉动物,腹主动脉采血制备含药血清。2.在体外L-02细胞中,分别加入不同体积比(5%、2.5%、1.25%)的葛黄颗粒含药血清及不同体积比的(5%、2.5%、1.25%)阳性对照药美他多辛含药血清,利用CCK8法检测细胞活力,观察含药血清对L-02细胞活力的影响。3.选取乙醇终浓度为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%分别作用于L-02细胞6h、12h、24h进行造模。采用CCK8法检测细胞活力筛选出最佳乙醇浓度作用范围,同时用全自动生化分析仪检测细胞上清液AST、LDH酶活力,结合CCK8结果,以确定造模时间及造模的乙醇浓度。3、以3%的乙醇浓度诱导损伤L-02细胞24h,然后以不同体积比(5%、2.5%、1.25%)的葛黄颗粒含药血清(即分为GHG5%组、GHG2.5%组、GHG1.25%组)及5%体积比的美他多辛含药血清(即阳性对照组)培养L-02细胞6h、12h、24h,收集细胞培养上清液。利用全自动生化分析仪检测细胞上清液AST、LDH酶活力,验证葛黄颗粒含药血清保肝、降酶的作用,同时筛选出葛黄颗粒含药血清的最佳作用浓度及时间为后续实验所用。4、据2、3中所得结果,以3%的乙醇浓度诱导损伤L-02细胞24h后,以5%体积比的葛黄颗粒含药血清及5%体积比的美他多辛含药血清培养L-02细胞24h后收集细胞,利用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及赖氏法测定L-02细胞中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活力,利用流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平、JC-1法检测线粒体膜电位(MMP)水平,全自动酶标仪检测三磷酸腺苷(ATP)含量来阐明其对乙醇诱导的L-02细胞氧化应激损伤中线粒体功能的保护作用。结果:1.分别以3.1g生药/100g体重/天及美他多辛0.1g/100g体重/天给大鼠灌胃,制备葛黄颗粒及美他多辛含药血清。不同浓度的葛黄颗粒含药血清及美他多辛含药血清分别作用于L-02细胞24h,各组细胞活力无显著改变(P0.05)。2.当乙醇浓度低于1.0%时,各作用时间点的细胞活力均大于对照组(P0.05),显微镜下观察细胞形态无明显改变。当乙醇浓度在1.5%-3.0%时,细胞活力随着乙醇浓度的增加及作用时间的延长呈逐渐减弱趋势,但均在75%以上(P0.05),显微镜下观察细胞数较正常组有所减少,部分呈圆形,体积稍增大,少数细胞结构不清,可见到核融解和核膜破裂,漂浮细胞增多;当乙醇浓度为5%时,细胞活力明显减弱(P0.05),显微镜下观察细胞数较正常组明显稀少,大部分呈圆形,体积明显增大,细胞结构不清,并出现大量核融解和核膜破裂现象,漂浮细胞明显增多;当乙醇浓度为2.5%、3%、5%时,干预24h后AST、LDH含量明显升高(P0.05)。最终选取3%乙醇浓度作用L-02细胞24h建立酒精性L-02细胞损伤模型以完成后续实验。3.含药血清作用6h后对细胞上清液中AST、LDH的含量无明显变化,在作用12h后5%体积比葛黄颗粒、美他多辛含药血清组细胞上清液中AST、LDH的含量有所下降(P0.05);在作用24h后2.5%体积比葛黄颗粒、美他多辛含药血清组细胞上清液中AST、LDH的含量有所下降(P0.05),5%体积比葛黄颗粒、美他多辛含药血清组细胞上清液中AST、LDH的含量明显下降(P0.05),两组间无显著差异(P0.05)。因此,在后续实验中选取5%作为葛黄颗粒含药血清最佳作用浓度,24h为最佳作用时间。4.与正常对照组比较,模型组的SOD、GSH-Px酶活力均显著降低(P0.05);MDA含量均显著升高(P0.05);与模型组比较,GHG5%组及阳性对照组GSH-Px酶活力均显著升高(P0.05),MDA含量均显著降低(P0.05)。5.与正常对照组比较,模型组的ROS水平显著升高(P0.05),MMP水平明显降低(P0.05),ATP含量明显减少(P0.05);与模型组比较,GHG5%组及阳性对照组ROS水平显著降低(P0.05),MMP水平明显升高(P0.05),ATP含量明显增多(P0.05)。结论:1.葛黄颗粒含药血清对正常L-02细胞生长无明显影响;2.乙醇影响培养L-02细胞活力,诱导细胞死亡;3.葛黄颗粒含药血清抑制乙醇诱导的L-02细胞AST、LDH泄漏,降低细胞中MDA、ROS含量,增加胞内SOD、GSH-Px活力,提高线粒体膜电位,增加胞内ATP含量,提示其可能通过调整细胞内氧化应激水平和保护线粒体功能而起到解酒、保肝、降酶作用。这些研究结果为葛黄颗粒的新药开发和临床应用提供了理论依据。
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【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】