家族型肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓前角细胞雄激素受体的表达特征

发布时间：2018-10-21 17:17

【摘要】：目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种病因未明神经系统变性病，选择性损伤大脑皮层运动神经元、脑干运动神经核神经元、脊髓前角a运动神经元，导致进行性加重的肌肉无力、萎缩，最终因呼吸肌麻痹死亡。有许多流行病学的危险因素，例如暴露于重金属、电或机械损伤、剧烈的体育活动都会影响到肌萎缩侧索硬化（ALS）的发病。但是还有两个广为接受的危险因素：年龄和性别。研究表明男性发病率高于女性，49岁以前男女发病率之比为3.98:1，55岁以后男女发病率之比为1.63:1；且男性发病早于女性[1]；家族性ALS动物模型SOD1G93A转基因小鼠的发病时间雄性早于雌性，生存时间雌性大于雄性[2]，说明性别可能是其ALS发病的危险因素，性激素可能对ALS发病过程中神经元的变性、丢失发挥作用。另有研究发现ALS患者男性以肢体发病为主，女性以球部发病为主[1]。肯尼迪病是一种X-连锁的雄激素受体基因突变引起的运动神经元病，主要影响高位颈髓及延髓的下运动神经元，以上肢发病常见[3]。家族性肌萎缩侧索硬化动物模型（SOD1G93A转基因小鼠）的特征性临床表现为成年（12周左右）发病，后肢运动功能障碍并逐渐进展至终末期（17-20周）[4]。目前有关雄激素受体（AR）在ALS小鼠脊髓表达情况的报道少见。本实验应用免疫荧光的方法，观察家族型肌萎缩侧索硬化动物模型（SOD1G93A转基因小鼠）病程腰段脊髓前角细胞雄激素受体的表达与分布情况,应用免疫组化的方法计数家族型肌萎缩侧索硬化动物模型（SOD1G93A转基因小鼠）病程腰段脊髓前角运动神经元数目及观察运动神经元雄激素受体的表达情况,旨在探讨ALS的发病过程中雄激素受体的作用，为ALS发病机制研究提供一定的理论基础。方法： 1模型建立及分组 B6SJL-BTg（SOD1G93A）1Gur/J半合子雄鼠与B6SJLF1/J+/+雌鼠1:1杂交，在恒温、恒湿、12h光照/黑暗交替循环、无特殊病原菌的（Specificpathogen free， SPF）环境中，喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料及灭菌水，经剪尾尖提取DNA、PCR扩增后、琼脂糖凝胶电泳结果示（Fig.1）：位于200-300bp之间的条带（236bp）为mSOD1的PCR产物，此种小鼠为SOD1G93A转基因阳性小鼠。没有此条带为非mSOD1的PCR产物，为非SOD1G93A转基因鼠。参考Vercelli A[5]等的1-5分评分法进行评分,4分为发病时间，1分为死亡时间,60天为症状前期，4分为症状早期，1分为终末期。各对照组为同窝、同月龄未转人突变的SOD1基因的小鼠。每组雌雄各3只小鼠。 2取材 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心脏灌注4%多聚甲醛固定20min，取小鼠腰段脊髓，以4%多聚甲醛固定48h。 3免疫荧光后固定的组织块震荡切片25μm厚，应用免疫荧光三标染色的方法在激光共聚焦显微镜下观察雄激素受体在SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓前角中的细胞定位。 4免疫组化染色后固定的组织块震荡切片25μm厚，应用ABC方法进行SMI-32及AR免疫组化染色，计数脊髓前角运动神经元数量及观察运动神经元AR受体表达。脊髓前角α运动神经元数量的计数方法：对连续切片的每第五张切片的双侧脊髓前角的α运动神经元计数，每段腰髓观察10个切片。被计数的α运动神经元标准为：位于前角、直径＞25μm，细胞核清楚[6]。 5统计学处理采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。采用均数标准差表示腰膨大脊髓切片两侧神经元计数之和，三组数据的比较采用单因素方差分析，两组数据的比较采用两个独立样本比较的t检验，以a=0.05为显著性检验标准。结果： 1模型建立如Fig.1所示：位于200-300bp之间的条带（236bp）为mSOD1的PCR产物，此种小鼠为SOD1G93A转基因阳性小鼠。没有此条带为非mSOD1的PCR产物，为非SOD1G93A转基因鼠。 2免疫荧光 SOD1G93A转基因小鼠脊髓前角运动神经元有雄激素受体表达，且位于胞浆，而星型胶质细胞和小胶质细胞均无雄激素受体表达；对照组与ALS小鼠一致（Fig.2）。 3免疫组化染色(SMI-32) SOD1G93A转基因雄性小鼠在症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为20.672.92、14.732.84、8.472.72，各组比较P值分别为0.000、0.000、0.000，差别均有统计学意义（Fig.3，Table1）。SOD1G93A转基因雌性小鼠在症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为20.603.20、17.473.40、8.473.44，各组比较P值分别为0.015、0.000、0.000，差别均有统计学意义（Fig.4，Table2）。雄雌对比，P值分别为0.953、0.024、1.000，仅发病期差别有统计学意义（Fig.5，Table3）。 4免疫组化染色(AR) 4.1与免疫荧光结果一致，SOD1G93A转基因小鼠AR表达于脊髓前角运动神经元，且位于胞浆，胞浆着色均匀一致，随病情进展，未出现颗粒样沉积。对照组与ALS小鼠一致（Fig.6）。 4.2SOD1G93A转基因雄性小鼠在症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为20.871.81、14.931.67、8.671.23，各组比较P值分别为0.000、0.000、0.000，差别均有统计学意义（Fig.7，Table4）。SOD1G93A转基因雌性小鼠在症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为20.801.97、17.672.13、8.671.59，各组比较P值分别为0.000、0.000、0.000，差别均有统计学意义（Fig.8，Table5）。雄雌对比，P值分别为0.924、0.001、1.000，仅发病期差别有统计学意义（Fig.9，Table6）。5免疫组化(SMI-32)和免疫组化(AR)的比较 SOD1G93A转基因雄性小鼠各期SMI-32免疫阳性的神经元计数与AR免疫阳性的神经元计数相比，P值分别0.823、0.816、0.798，差异均无统计学意义（Fig.10，Table7）。SOD1G93A转基因雌性小鼠P值分别为0.839、0.848、0.840，差异均无统计学意义（Fig.11，Table8）。结论： 1.正常小鼠腰段脊髓前角细胞：雄激素受体（AR）在运动神经元表达，且位于胞浆，星型胶质细胞及小胶质细胞均无表达。 2.SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓前角细胞：雄激素受体（AR）在运动神经元表达，且位于胞浆，星型胶质细胞及小胶质细胞均无异常表达。 3.SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓前角雄激素受体（AR)逐渐减少,与病程进展中运动神经元数目减少有关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R744

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