右美托咪定对家兔脊髓缺血再灌注损伤后Bax,Bcl-2,Caspase-3表达的影响

发布时间：2018-10-22 09:28

【摘要】：研究背景脊髓缺血再灌注损伤(Spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCIRI)一直是神经科学研究的难点之一,SCIRI是指在某种损伤因素作用下脊髓经过一定时间缺血后得到血液再灌注后出现明显的功能障碍,甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象。脊髓缺血再灌注的主要损伤因素在于再灌注后的继发性损伤,决定了脊髓缺血再灌注损伤的预后。继发损伤的发病机制主要涉及神经细胞氧化应激损伤以及凋亡等机制,因此保护脊髓神经元,避免神经元氧化应激损伤以及凋亡,是治疗脊髓缺血再灌注损伤的关键所在。尽管临床上已采用多种方法减轻脊髓缺血损伤,但是胸腹主动脉瘤手术患者不可避免发生脊髓缺血,有数据显示3%～18%患者发生永久性损伤(急性截瘫和/或延迟性截瘫)。除此之外,脊髓肿瘤压迫,脊柱畸形,椎管狭窄等患者围手术期也会出现脊髓缺血/再灌注损伤。截瘫造成患者失去工作能力并担负巨额的医疗费用,给患者本人及家庭造成深痛的打击和巨大的经济负担,同时加重整个社会的医疗保险的负担。右美托咪定是一种新型的高选择性α2肾上腺素受体激动剂,可产生剂量依赖性的镇静、镇痛和抗焦虑作用,因此被广泛用于手术室和ICU患者。除此之外,右美托咪定的其他临床作用也被广受关注。研究发现右美托咪定对卒中模型、创伤性脊髓损伤具有神经保护作用。右美托咪定对心肌、肺、肾脏的保护作用亦有报道。研究目的观察右美托咪定对兔脊髓缺血再灌注损伤后的后肢神经功能、组织病理学、脊髓组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)表达的影响,探讨右美托咪定预处理对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用的可能机制,为临床研究提供理论依据。研究方法脊髓缺血再灌注损伤的程度及其变化规律直接关系到脊髓继发损伤程度及损伤机制,其中动物模型的选择对研究结果的意义具有重要的影响。许多致脊髓缺血的因素仍未建立满意的损伤模型,目前SCIRI模型繁多,常见包括腹主动脉阻断法和腰动脉阻断法建立的脊髓缺血再灌注模型,但尚无统一的分型和分级,而应用单一SCIRI模型进行研究,显然不能满足临床治疗的需要。目前,SCIRI的研究主要以腰段脊髓为研究对象,且倾向于选择兔作为实验研究对象。腰段脊髓的血液供应主要来自肾下腹主动脉,兔腹主动脉及腰动脉动脉壁相对较厚,内径粗,游离时不易出血,腰动脉系腹主动脉的直接分支,常与静脉伴行,且血管压力高,血管壁薄,容易误伤,一旦误伤血管,因腹膜后间隙较小而止血困难,加之不同种属兔子的腰动脉解剖差异较大,腰动脉多为3支以上,其腰动脉分支的数目、走行和直径的明显变异可能直接影响模型的稳定性和研究结果。此外,由于腹膜后间隙较小,逐一寻找各腰动脉并将其全部结扎,尤其是结扎肾动脉上分支和髂总动脉下分支时,手术难度更大,延长了手术时间,这种高选性的完全结扎节段动脉的手术方法操作过程比较复杂,虽然不影响其他区域的血液供应,但造成脊髓永久性缺血损伤,且无再灌注过程,因此不符合本研究目的。鉴于以上原因,本研究在肾动脉分支下阻断腹主动脉,采用改良的Zivin法制作脊髓缺血再灌注损伤模型,通过控制夹闭时间长短而引起脊髓组织不同程度损伤,手术简便易行,损伤程度易于控制。具体操作步骤如下：腹部备皮,常规碘伏消毒,铺无菌单。取腹正中切口,触摸左侧肾脏上极后,约剑突下2.5cm至耻骨联合上5cm之间,逐层分离腹壁各层,进入腹腔后将肠管推至右侧,并以温生理盐水纱垫覆盖,确认左肾动脉和腹主动脉后,自腹膜后间隙左肾动脉下钝性分离显露腹主动脉。于左肾动脉起始处下方0.5cm～1cm处,完全夹闭腹主动脉,监测股动脉平均动脉压降至OkPa (MAP=0mmHg),计时40mim后,开放腹主动脉。夹闭前5分钟,经耳缘静脉注射肝素钠150U/kg。术毕检查腹腔无渗血后以庆大霉素8万单位及甲硝唑10ml冲洗腹腔,逐层缝合腹部切口。 24只新西兰兔随机分为3组,每组8只,假手术组(S组),缺血再灌注组(I/R组),右美托咪定预处理组(DEX+I/R组)。假手术组不阻断腹主动脉,仅实施麻醉及手术操作。缺血再灌注组阻断腹主动脉40分钟后开放灌注,右美托咪定预处理组静脉持续泵注右美托咪定2.5μg/(kg·h)60min,然后完全夹闭腹主动脉,监测股动脉平均动脉压降至0kPa(MAP=0mmHg)后,夹闭腹主动脉4Omin开放。S组与I/R组用0.9%生理盐水5m1/kg替代。再灌注4小时,12小时,24小时,48小时观察动物后肢活动并进行神经功能评分。手术各组分别于再灌注后48小时后取实验动物L2-5脊髓节段行病理学检查,采用HE染色观察脊髓标本的一般病理学改变,TUNEL法染色观察脊髓标本的细胞凋亡情况,分别使用Western-blot、免疫组化染色法检测脊髓组织中Bc1-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达。Elisa法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性。研究结果所有实验动物在试验周期内(2天)均存活,动物存活率100%。5例术后出现尿储留,经保守治疗(膀胱按摩)后好转。实验过程中,各组动物呼吸、心率、血压、体温等生命体征平稳。术后腹部切口对良好,无红肿以及脓性分泌物。 1.本实验使用Tarlov评分系统评估后肢神经功能。I/R组,DEX+I/R组在再灌注后均有不同程度的下肢瘫痪。DEX+I/R组于再灌注后各观察时间点后肢神经功能评分(改良Tarlov评分)均高于I/R组(P0.05)。 2.S组,I/R组和DEX+I/R组于再灌注后48h脊髓组织切片HE染色,光学显微镜下观察可发现：s组：显示神经细胞结构形态正常。正常运动神经元数目较多,轮廓清楚,神经细胞周围无散在的空泡形成；细胞成多角形；胞浆均匀红染,内有尼氏体呈颗粒状均匀分布；细胞核成圆形,核仁明显。I/R组：显示神经细胞结构不清。正常运动神经元数目极少。神经细胞固缩；尼氏体淡染,胞浆中出现空泡状改变；核萎缩,核仁消失；组织中血管及实质可见散在的大小不等的出血灶。DEX+IR组：显示神经细胞形态结构基本正常,有轻度的水肿；正常细胞仍较I/R组多;部分神经细胞也发生了胞质和核质模糊性改变,空泡较I/R组少,未见明显出血灶。DEX+I/R组(右美托咪定预处理组)脊髓前角正常运动神经元的百分率较I/R组(缺血再灌注组)明显增加,差别有统计学意义(P0.05)。 3.s组,I/R组和DEX+I/R组于再灌注后48h脊髓组织切片TUNEL染色,光学显微镜下观察可发现：s组：显示神经细胞结构形态正常,脊髓前角运动神经元中见少量TUNEL染色；I/R组：显示脊髓前角内有大量空泡形成,内可见TUNEL阳性的棕色运动神经元核数目较多。DEX+I/R组：显示脊髓前角内空泡和TUNEL阳性的凋亡神经细胞数目较1/R组均明显减少。计算再灌注后48h的脊髓前角正常运动神经元及TUNEL阳性的凋亡神经细胞数目,按照(TUNEL阳性神经元数/神经元总数)×100%计算脊髓神经元的凋亡指数：S组(假手术组)可见极少量TUNEL阳性染色细胞。I/R组TUNEL阳性染色细胞数目显著增多。DEX+I/R组(右美托咪定预处理组)TUNEL阳性染色细胞数目较I/R组(缺血再灌注组)显著减少,差别有统计学意义(P0.05)。 4.Western-blot和免疫组化染色检测脊髓组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达发现,与S组相比较,I/R组Bax蛋白表达显著增加；DEX+I/R组(右美托咪定预处理组)Bax蛋白表达较I/R组显著减少。DEX+I/R组(右美托咪定预处理组)Bcl-2蛋白表达较I/R组和s组均显著增加。DEX+I/R组(右美托咪定预处理组)Caspase-3蛋白表达较I/R组显著减少。 5.Elisa法检测发现,I/R组与DEX+I/R组比较,脊髓缺血再灌注后脊髓组织SOD活性均较低(P0.05),而MDA含量均增多(P0.05)。研究结论 1.通过形态学证实右美托咪定确实能有效对脊髓缺血再灌注损伤后的脊髓神经细胞起一定的保护作用。 2.在脊髓缺血再灌注损伤中,右美托咪定通过促进Bcl-2蛋白表达上调、抑制Bax、Caspase-3蛋白表达,从而减少神经细胞调亡,对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。 3.右美托咪定对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用可能与其抑制脂质过氧化有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R614

【参考文献】