【摘要】：研究背景与目的尽管已有有效的疫苗,但是,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus HBV)感染仍然是一个主要的健康问题。全球大约有2.48亿的乙肝病毒慢性感染者。乙肝病毒有两种常见表型,30年前,HBeAg(HBV e antigen HBeAg)阳性的野生型病毒株为主要的流行株,近几年,HBeAg阴性HBV病毒株的感染呈上升趋势。HBeAg阳性和阴性两种类型的慢性感染者在流行病学、发病机理、自然病程、预后及治疗等方面都有很大的不同。HBeAg阴性患者对抗病毒治疗相比HBeAg阳性病人持续应答率低,治疗时间长,发展成肝癌的风险更大。因此,开展HBeAg阴性HBV发病机制及其治疗药物的研究具有很重要的意义。实验动物模型在疾病发病机理及药物研发中具有重要作用。目前,很少有关于HBV HBeAg阴性模型的报道。因此,本实验旨在建立一个能模拟HBeAg阴性HBV持续感染的小鼠模型。方法1.分析53例HBV病人HBsAg及HBeAg的携带状况,通过SNa Pshot进行病毒基因型的鉴定。2.以临床病人血清为模板,通过PCR扩增HBeAg阴性HBV全长基因,通过分子生物学方法将全长基因克隆至pEASY-Blunt Simple载体,构建pEASY-HBeAg-negative HBV质粒,测序鉴定;测序结果在Gen Bank中进行比对分析。3.用Bsp QI酶切pEASY-HBeAg-negative HBV质粒,胶回收线状目的片段,然后通过T4DNA连接酶过夜连接,使其在体外环化成共价闭合环状的DNA(covalently closed circμlar cccDNA),对环化产物进行Eco RI及PSAD酶切鉴定及测序鉴定。4.通过流体动力学的方法将cccDNA及p AAV/HBV1.2质粒通过尾静脉分别注射到C57BL/6J小鼠中,注射后,分别于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w通过小鼠尾静脉采集血清样本;于第3w和10w经麻醉后颈椎脱臼处死,然后取肝组织。5.通过放射免疫法在设定的时间点检测病毒血清特异性标志HBsAg和HBeAg的表达;通过免疫组织化学的方法检测肝脏组织中HBsAg及HBcAg的表达;苏木素-伊红(HE)染色及酶联免疫反应观察肝脏的病理变化及血清中转氨酶的活性变化;利用荧光定量的方法检测血清及肝脏中HBV DNA拷贝数,并利用滚环扩增联合PCR的方法检测肝脏中cccDNA的表达。结果1.53例HBV感染患者中,27名HBV阳性的患者HBeAg检测为阴性,占感染总人数的50.9%;HBV A基因型感染者1例,B基因型38例,C型感染者14例。2克隆基因与Gen Bank中JX661478.1号HBV基因序列可达98%的同源性;基因的4个开放读码框完整,基础核心启动子区(BCP)存在A1762T,G1764A的双突变,减少了HBeAg的表达;前C区存在G1896A的突变,提前终止HBeAg的表达。3.测序及酶切验证都显示,线性DNA被环化为cccDNA,没有碱基的缺失及外源基因的插入。4.在注射HBeAg阴性cccDNA的小鼠中,注射5周内,HBV感染率达到100%;HBsAg水平迅速升高,并在第一周时达到峰值,随后迅速下降;60%的cccDNA注射小鼠,HBsAg和HBcAg可持续表达超过10周;所有小鼠,HBeAg阴性;血清和肝脏中HBV DNA含量可分别达107拷贝/ml和108拷贝/ml;肝脏组织中可检测到cccDNA的表达。p AAV-HBV 1.2质粒小鼠,血清及肝脏中可检测到HBsAg、HBeAg或HBsAg、HBcAg。结论首次在具有免疫活性的小鼠中成功建立了HBeAg阴性的HBV持续性感染的动物模型。HBeAg阴性的模型小鼠与p AAV-HBV1.2模型小鼠相比,感染持续性、血清病毒学(HBeAg除外)和生物化学标记物的水平没有显著性差异(P0.05)。该模型将为HBeAg阴性HBV感染的机理研究奠定基础,并将有助于新的抗病毒药物的评价。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R512.62;R-332
【参考文献】
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2292335
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