针刺调控下丘脑胰岛素PI3K信号通路改善胰岛素抵抗的机制研究

发布时间：2018-10-26 07:18

【摘要】：目的：本课题在中医针灸学“治未病”理论的指导下，从外周形态学、糖代谢和脂质代谢水平，及中枢细胞因子水平，研究电针对胰岛素抵抗模型大鼠血清FIN、 FBG、BW、FFA、TG、TC，和下丘脑PI3K信号通路相关分子的调节机制，进一步探讨和分析电针对胰岛素抵抗模型大鼠的治疗效应。方法：选用清洁级雄性8周龄Wistar大鼠60只(由湖北省动物疫病预防控制中心提供，动物许可证号: SCXK鄂2008－005，体重180±20g，饲养于湖北中医药大学针灸研究所动物饲养室,（温度18~25℃，湿度45%~55%）。适应性喂养3天后随机分为对照组、模型组、预防组、“双固一通”电针组（简称：电针组）、脑室灌注脑脊液组（简称：脑脊液组），和脑室灌注阻滞剂组（简称：阻滞剂组），每组10只。正常组给予标准饮食（3.8kcal/g，含70%碳水化合物,20%蛋白质,10%脂肪）；其余各组采用高脂饲料高脂饲料(总热能为5.4kcal/g,含38.5%碳水化合物，15%蛋白质，46.5%脂肪)，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。喂养8周后，大鼠尾静脉采血检测FPG、Fins，计算胰岛素敏感指数的自然对数（IAI）即1/[FPG (mmol/L)×FIN (mIU/L)]为表示，当模型组大鼠IAI与正常组比较明显降低（P0.05）时为造模成功。（1）阻滞剂组大鼠称重后，以10%水合氯醛（30mg/kg）腹腔麻醉。将大鼠固定于脑立体定位仪，头顶局部常规备皮、消毒，依照立体定位图谱进行定位，于前囟后0.8mm，在中位颅盖骨处用牙科钻钻一孔直径2mm的孔。以不锈钢导管插入（长18.0mm，外径0.64mm，内经0.39mm）留置；用带帽的不锈钢制导丝（长17.0mm，直径0.33mm），插入已经置入的不锈钢导管内用以封闭导管。用牙科粘合剂与导管固定。手术后6-8小时大鼠可清醒，缝合皮肤，预防感染，将大鼠置于空笼内待其苏醒。术后二日起，，将管内芯隔日抽出，用人工脑脊液清洗，以保持不锈钢导管内清洁。注射时，抽出将管内芯，将微量注射器与内径0.3mm的聚氯乙烯导管(自己拉制成)与不锈钢管相连，取wortmannin(50nmol/L，3mg/kg体重)，缓慢给药，注射速度维持在1μL/min。注射完毕后留针8-10min，再缓慢退针，以防药物沿针道返流颅外。（2）脑脊液组大鼠称重后，脑室留管的方法与阻滞剂组相同，脑脊液按照Na+145.5ml/L, K+2.8mol/L, Ca2+2.3mol/L, Mg2+2.2mol, Cl-128.5mol/L, HCO-323.l mol/L, H-2Po4ll mol/L,葡萄糖0.6l g/L,渗透压289.omosM/L, PH值7.3配置完成，等量灌注，操作方法与阻滞剂组相同。使用0.30×25mm不锈钢毫针，于大鼠关元穴、后三里穴、丰隆穴和中脘穴进行毫针针刺。足三里穴（后三里穴）和丰隆穴直刺入5-10mm，关元穴向剑突方向，同时中脘穴向耻骨联合方向斜刺5-7mm。采用电针治疗仪（HANS-100A型），连续波，频率（2Hz），强度（1mA），通电（10min），同侧足三里穴和丰隆穴连接同一输出的两个电极，关元穴和中脘穴连接另一输出的两个电极。刺激强度根据局部肌肉收缩情况决定。每日电针10分钟，每周5次治疗，总疗程为8周。结果： 1.各组大鼠实验开始8thw造模完成时，与正常组大鼠相比较，模型组、预防组、电针组、脑脊液组、阻滞剂组大鼠的BW、FPG、FINS明显升高（p0.01）。16thw治疗结束后，与正常组大鼠相比较，模型组大鼠的BW、FPG、FINS明显升高（p0.01）；与模型组大鼠相比较，预防组与电针组大鼠BW、FPG、FINS降低（p0.05）；与阻滞剂组大鼠相比较，脑脊液组大鼠BW、FPG、FINS降低（p0.05）。与正常组大鼠相比较，模型组大鼠的IAI明显降低（p0.01）；与模型组大鼠相比较，预防组与电针组大鼠IAI升高（p0.05）；与阻滞剂组大鼠相比较，脑脊液组大鼠IAI升高（p0.05） 2.实验结果显示，造模完成后模型组大鼠的TC、TG、FFA明显升高（p0.01）；16w电针治疗结束后较，预防组、电针组大鼠TC、TG、FFA降低（p0.05），与模型组大鼠的TC、TG、FFA检测结果比较，具有显著差异；与阻滞剂组大鼠相比较，脑脊液组大鼠TG、FFA降低（p0.05）, TC值无明显差异（p0.05）。 3.免疫组化实验结果显示，与正常组大鼠相比较，模型组大鼠IRS2IOD值明显降低（p0.01）；电针治疗结束后，预防组、电针组大鼠IRS2IOD值升高（p0.05）与模型组大鼠相比较具有显著差异；与阻滞剂组大鼠相比较，脑脊液组大鼠IRS2IOD值升高（p0.05）。 4. Western-blot实验结果显示，与正常组比较，模型组、阻滞剂组大鼠下丘脑中PI3Kp110蛋白表达明显减少（P＜0.01）；与模型组相比较，预防组、电针组、脑脊液组大鼠下丘脑中PI3Kp110蛋白表达明显提高（P＜0.05）；与阻滞剂组比较，预防组（P＜0.01）、电针组（P＜0.01）、脑脊液组（P＜0.05）大鼠下丘脑中PI3Kp110蛋白表达明显提高。另外，与正常组比较，模型组、阻滞剂组大鼠下丘脑中p-PI3Kp110蛋白表达明显减少（P＜0.01）；与模型组相比较，预防组、电针组大鼠下丘脑中p-PI3Kp110蛋白表达明显提高（P＜0.05）；与阻滞剂组比较，脑脊液组大鼠下丘脑中p-PI3Kp110蛋白表达明显提高（P＜0.05）。 5. Real-timePCR实验结果显示，与正常组大鼠相比较，模型组大鼠下丘脑Akt2mRNA表达明显降低（p0.01）；与模型组大鼠相比较，预防组和电针组脑Akt2mRNA表达升高（p0.05）；与阻滞剂组大鼠相比较，脑脊液组鼠下丘脑Akt2mRNA表达升高（p0.05）。结论： 1.与模型组大鼠相比较，电针治疗可以有效降低胰岛素抵抗模型大鼠的体质量，调节其血糖和空腹胰岛素浓度。 2.电针治疗可以有效降低胰岛素抵抗模型大鼠的游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇的浓度，缓解因胰岛素抵抗引起的脂质代谢异常。 3.电针治疗可以调节胰岛素抵抗模型大鼠下丘脑中IRS-2的含量，提高PI3Kp110、p-PI3Kp110的蛋白表达，和Akt2mRNA的基因表达，说明电针可以通过调节PI3K信号通路相关信号分子，从而缓解胰岛素抵抗。
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【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R245

【参考文献】