非洲天门冬提取物WADM-3对胶质瘤干细胞杀伤作用的研究

发布时间：2018-11-14 21:06

【摘要】：目的:肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在是肿瘤耐药、复发和转移的主要原因,因此CSCs成为肿瘤治疗的主要靶细胞。胶质瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)是恶性程度很高的脑肿瘤,具有死亡率高、生存期短的特点。植物药在肿瘤治疗研究中占有非常重要的地位,非洲天门冬属于非洲藤本、蔓生植物,生长于热带或气候温和地区,广泛分布于我国各地,资源丰富。课题组在对植物药提取成分进行抗肿瘤活性物大通量筛选后,发现非洲天门冬提取物WADM-3可靶向杀伤胶质母细胞瘤干细胞(Glioma Stem Cells,GSCs)。本研究对WADM-3杀伤GSCs的作用进行研究,在细胞水平上探讨其杀伤GSCs可能机制;动物模型是筛选新药的基础,同时我们成功建立胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)原位移植瘤小鼠模型,为发现靶向GSCs天然活性药物提供理论基础。方法:1.天然提取物中抗肿瘤成分的筛选对获得的植物组分进行筛选。基于GSCs筛选,同时将活性组分作用于NSCs、胶质瘤细胞T98G、胶质瘤细胞U-87MG。消化GSCs-3#体外培养细胞后制备成单细胞悬液,接种在laminin包被的96孔板上20000cells/孔,培养24h后加入10ug/ml浓度WADM-3,分别于作用后24h、48h、72h观察细胞状态。2.非洲天门冬提取物对GSCs的杀伤作用2.1非洲天门冬提取物对GSCs及NSCs细胞毒性测试采用GSCs和正常NSCs同时进行体外细胞毒性测试以证实提取物抗肿瘤作用。将GSCs和NSCs铺至24孔培养板(20000cells/孔)。24小时后将10ug/ml浓度的非洲天门冬提取物作用于细胞,分别于作用后24h、48h、72h观察细胞状态。通过评价非洲天门冬提取物对GSCs和NSCs产生的不同毒性作用,明确其对GSCs具有的靶向杀伤作用,并探讨其产生的可能机制。2.2非洲天门冬提取物对GSCs的IC50的测定细胞消化后将细胞接种在在96孔板上(20000cells/孔),培养24h后添加非洲天门冬提取物。提取物按终浓度20mg/ml,2倍梯度浓度进行稀释,与培养基混匀后加入细胞培养板上。培养72h后,吸去培养孔中培养基,将MTS按1:10比例与培养基混匀后,加入100ml/孔到培养板上,培养1h后,利用酶标仪测量其在490nm处吸光值,计算IC50值。2.3非洲天门冬提取物对GSCs克隆形成能力(Colony efficiency,CE)的测试GSCs与软琼脂混匀后平铺在6孔板内(30000cells/孔),放置培养箱培养,每隔5天更换一次培养基,待克隆形成后将非洲天门冬提取物按照10ug/ml浓度加到孔板上,对照组加同样浓度的二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO),10天后,用含有0.05%结晶紫的多聚甲醛固定细胞,计数克隆数。观察非洲天门冬提取物过GSCs体外克隆形成能力的影响,评价提取物对GSCs的抑制及杀伤作用。3.非洲天门冬提取物对GSCs杀伤作用的机制研究3.1非洲天门冬提取物对GSCs细胞增殖的作用检测GSCs细胞消化后以6×104密度铺24孔板。48小时后,加入5mg/ml终浓度的提取物进行处理。培养24h后细胞出现细胞毒表型,进行Brd U抗体染色,利用免疫荧光技术追踪增殖的细胞。同时利用DAPI对正常细胞进行染色。经双重染色对比后观察细胞增殖情况。通过对细胞增殖检测结果评价提取物靶向杀伤GSCs的作用是否通过抑制细胞增殖实现,探讨其杀伤GSCs的作用机制。3.2非洲天门冬提取物对GSCs凋亡的作用检测GSCs细胞消化后以6×104密度铺24孔板。48小时后,加入5mg/ml终浓度的提取物进行处理。培养24h后细胞出现细胞毒表型,进行Caspase-3抗体染色,利用免疫荧光技术追踪凋亡的细胞。同时利用DAPI对正常细胞进行染色。经双重染色对比后观察细胞凋亡情况。通过对细胞凋亡的检测结果评价提取物杀伤GSCs的作用是否通过诱导其凋亡而产生,探讨其杀伤GSCs的作用机制。3.3非洲天门冬提取物对细胞周期的影响将非洲天门冬提取物作用于GSCs,培养48H后,PI染色后通过流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)分析非洲天门冬提取物作用于GSCs对细胞周期分布的影响,探讨提取物对GSCs杀伤的作用机制。4.GBM原位移植瘤小鼠模型的建立4.1 GSCs的体外贴壁培养实验所用GSCs为本课题组前期从临床肿瘤中分离出来的。采用贴壁培养方式体外培养培养GSCs,为在整体及细胞水平上研究非洲天门冬提取物抗肿瘤效果提供基础。4.2小鼠的GBM原位移植瘤模型的建立采用非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠。小鼠麻醉后暴露头骨并将小鼠固定在脑立体定位仪上。头骨“十”字线向上1mm,向左2mm,即脑左侧纹状体部位进行钻孔,进针深度3mm,以0.2ul/min速度将2ul,30000个细胞悬液注入脑部。微量注射器显示注射完毕后,缝合小鼠并术后观察。4.3 GBM原位移植瘤小鼠模型瘤体组织的病理检查对GBM原位移植瘤小鼠模型脑部的病理组织进行HE染色以及组织化学免疫染色。组织蜡块用苏木素-伊红进行染色,对切片病理进行组织出血、坏死、浸润性生长观察。Ki67是标记细胞增殖抗原,Ki67抗体对模型脑部的病理组织进行组织化学免疫染色,同时加入DAPI染色正常细胞,双重染色后观察瘤体内肿瘤细胞增殖情况。结果:1.天然提取物中抗肿瘤成分的筛选52个天然提取物成分进行筛选,10个成分显示无效为假阳性活性物,对GSCs有细胞毒性的成分为42个;在42个复筛有效成分中仅有3个成分对NSC没有细胞毒性;在对胶质瘤细胞系T98G、U-87MG的筛选结果中显示42个有效成分中仅有3个成分对T98G、U-87MG有细胞毒性。2.非洲天门冬提取物对GSCs的杀伤作用2.1药物处理后形态学观察加入药物后,对培养板内GSCs与NSCs进行细胞形态学观察和比较,非洲天门冬提取物对GSCs有明显的细胞毒性而对NSCs几乎没有损伤。2.2 IC50检测结果发现,提取物对GSCs IC50的浓度为2.2-2.8ug/ml,远小于对于正常的NSCs IC50浓度(40ug/ml),表明非洲天门冬提取物对GSCs细胞具有靶向性的杀伤作用。2.3非洲天门冬提取物能破坏GSCs的克隆形成能力体外形成克隆实验表明非洲天门冬提取物不仅抑制克隆的继续生长,而且还将已形成的克隆杀死,最后导致克隆的破碎、死亡,而对照组添加溶剂DMSO对GSCs的克隆形成没有影响。3.非洲天门冬提取物对GSCs特异性杀伤作用机制探讨3.1利用Brdu抗体染色法进行细胞增殖检测结果表明非洲天门冬提取物对GSCs的增殖没有明显抑制作用(P=0.32),处理组的细胞的增殖比率(Growth Fraction,GF)为28.5%,对照处理组细胞的增殖比率为27.1%。3.2利用Caspase-3途径检测非洲天门冬提取物对GSCs凋亡结果表明活性成分显著诱导GSCs凋亡(P=0.0002)。非洲天门冬提取物处理组细胞凋亡率为20%,对照处理组的细胞凋亡率为5.1%,提示非洲天门冬提取物对GSCs的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡,而非抑制细胞增殖来实现的。3.3细胞周期检测非洲天门冬提取物作用GSCs 72小时后,细胞生长周期分布影响的实验表明提取物对细胞周期影响不大(P=0.48)。4.小鼠GBM模型的建立与评价小鼠注射后4周在注射部位发生明显肿瘤。通过病理切片的结果表明,GBM病理特征明显,提示小鼠GBM模型建立成功,可用于非洲天门冬活性物质对体内抗肿瘤的效果研究。结论:1.筛选出3个选择性杀伤GSCs有效成分,其中WADM-3为单体。2.WADM-3对GSCs具有靶向杀伤作用。3.WADM-3显著诱导GSCs凋亡,但并不明显抑制GSCs的增殖。4.建立的GBM原位移植瘤小鼠模型与临床病理特征类似,可用于GBM研究。
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【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5

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1 严兰珍;非洲天门冬提取物WADM-3对胶质瘤干细胞杀伤作用的研究[D];云南中医学院;2016年

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本文编号：2332312