黄芪主要有效成分对Aβ诱导阿尔茨海默病模型的干预及氧化机制研究

发布时间：2018-12-10 22:23

【摘要】：第一部分黄芪主要有效成分对Aβl诱导阿尔茨海默病模型大鼠的保护作用研究目的：阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进展性中枢神经退行性疾病,临床多发于老年人。其主要病理特征包括神经元间p淀粉样蛋白(Ap)沉积形成老年斑(SP),神经元内tau蛋白过度磷酸化形成纤维缠结(NFTs)以及特定脑区中枢胆碱能神经元的大量死亡与丢失。随着社会人口老龄化日益严重,AD对人类健康的危害日趋严重。据统计,在欧美国家AD已成为继心脏病、癌症、卒中之后的第4位死因,而在中国AD患者的人数己超过500万。因而,AD的防治已成为当前社会亟待解决的重大医学和社会问题之一。关于AD的发病机制研究,尚不十分清楚。大量研究证据支持Ap异常沉积导致的级联反应损伤学说,而在此过程中,氧化应激机制是AD形成和发展的关键因素之一。因而,本研究从中药黄芪有效成分黄芪总苷及黄芪甲苷,对AD大鼠学习记忆功能和氧化应激的作用为切入点,揭示黄芪主要有效成分防治AD的可能机制,为其用于临床治疗提供理论基础和科学依据。方法：选用成年雄性SD大鼠(体重250～300 g),以侧脑室注射Ap25-35制备海马损伤模拟大鼠AD模型。大鼠随机分组,分为对照组(假手术组)、模型组、黄芪总苷低剂量组(20mg/kg)、黄芪总苷中剂量组(40 mg/kg)、黄芪总苷高剂量组(80 mg/kg)黄芪甲苷组(50 mg/kg),每组各12只。在模型组和治疗组,采用侧脑室注射聚集态Ap25-35的方法制备AD大鼠模型。用无菌生理盐水将Ap25-35稀释成3 nmol/L的工作液,密封后放置于37℃无菌恒温培养箱中孵育1周,使其变成聚集状态。通过脑立体定位仪向大鼠侧脑室注入聚集态Aβ25-35 5 μ1(15 μg)；向假手术组侧脑室中注入等量的无菌生理盐水。手术后开始灌胃给药,连续21 d,模型组、对照组给予等量的生理盐水。手术后一周开始进行Morris水迷宫训练,连续5 d；手术后第14 d进行测试共记录3 d,观察各组大鼠学习记忆功能的变化,分析各组大鼠逃避潜伏期、游泳总距离、跨台次数及搜索策略的差异。Morris水迷宫测试后,部分大鼠经水合氯醛麻醉后,以4%多聚甲醛进行心脏灌注固定,取脑组织制作冰冻切片。以尼氏染色观察海马区域神经元细胞形态结构的变化,免疫组织化学法观察海马区域神经元形态及数量的变化,Hoechst33342染色检测神经元凋亡情况。部分大鼠在完成Morris水迷宫测试后,立即断头取脑制备海马组织匀浆,采用酶联免疫吸附法(ELISA),检测海马组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。数据均以均数±标准差表示,采用SPSS 15.0 for windows统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)分析或非配对t-检验,P0.05认为差异具有统计学意义。结果：1.水迷宫实验(1)水迷宫定位航行在Morris水迷宫定向航行实验中,正常组和假手术组大鼠比模型组和治疗组大鼠更容易搜索并找到安全平台。在测试第1天,Aβ组大鼠寻找安全平台的逃避潜伏期明显延长(P0.05),游泳总距离明显延长(P0.01)；在黄芪总苷低剂量组,逃避潜伏期和游泳总路程有缩短趋势,但无统计学差异；在黄芪总苷中剂量组、高剂量组和黄芪甲苷组,逃避潜伏期明显缩短(P0.01),而游泳总路程有缩短趋势,但无统计学差异。从测试第2天开始,与模型组比较,黄芪总苷低、中、高剂量组和黄芪甲苷组的逃避潜伏期均明显缩短；黄芪总苷高剂量组和黄芪甲苷组游泳总距离较模型缩短(P0.05),而黄芪总苷低、中剂量组游泳总距离未发现明显差异。在测试第3天,与模型组比较,除黄芪总苷低剂量组外,其余各治疗组逃避潜伏期及游泳总距离与模型组相比均有显著性差异(P0.05)。(2)水迷宫空间搜索能力与对照组相比,模型组大鼠在平台的停留时间明显延长(P0.05)；与模型组比较,黄芪总苷中剂量组、高剂量组大鼠在搜索平台停留时间明显缩短(P0.05),黄芪甲苷组大鼠在搜索平台停留时间明显缩短(P0.05)。与对照组相比,模型组大鼠跨平台次数明显减少(P0.05),黄芪总苷中剂量组、高剂量组大鼠跨平台次数明显增多,但未恢复到正常水平,黄芪甲苷组大鼠跨平台次数明显增多(P0.05)。与模型组比较,黄芪总苷低剂量组大鼠在平台停留时间和跨平台次数未发现显著统计学差异。与对照组相比较,模型组大鼠搜索策略评分明显降低(P0.05),黄芪总苷中剂量组和高剂量组较模型组搜索策略评分均明显增加(P0.05)；与模型组相比,黄芪甲苷组搜索策略评分也明显增高(P0.05)。2.病理组织学所见(1)尼氏染色正常组大鼠海马区域神经元细胞排列紧密,胞内尼氏小体丰富,染色较深,核呈淡蓝色；与对照组比较,模型组大鼠海马区域神经细胞染色变浅,尼氏小体数目减少,细胞排列稀疏,细胞间隙增大,分界不清；黄芪总苷各治疗组及黄芪甲苷组细胞数目有所增多,细胞间隙变小,神经元水肿有所减轻。(2)免疫荧光染色免疫荧光染色结果显示,与对照组相比较,AD大鼠模型组海马区域神经元细胞标记物(NeuN)阳性细胞数目明显减少(P0.05),黄芪总苷中剂量组、高剂量组和黄芪甲苷组较模型组大鼠海马区域NeuN阳性细胞数明显增加(P0.05)；提示黄芪总苷及黄芪甲苷对Ap诱导的海马神经元损伤具有一定的保护作用。3.氧化应激检测所见(1) GSH-Px活性ELISA结果显示,模型组大鼠海马组织匀浆GSH-Px活性较对照组明显降低(P0.05)；黄芪总苷中剂量组和高剂量组大鼠较模型组GSH-Px活性显著增高(P0.05),黄芪总苷低剂量组GSH-Px活性变化不明显；黄芪甲苷组大鼠海马GSH-Px活性明显增高(P0.01)。(2)SOD活性ELISA结果显示,模型组大鼠海马组织匀浆SOD活性较对照组明显下降(P0.05)；黄芪总苷高剂量组大鼠海马SOD活性较模型组显著升高(P0.05),黄芪总苷低剂量组和中剂量组大鼠海马SOD活性有所升高,但统计无显著性差异,黄芪甲苷组大鼠海马SOD活性升高不明显(P0.05)。(3)MDA含量ELISA结果显示,模型组大鼠海马组织匀浆MDA含量较对照组明显升高(P0.01)；黄芪总苷各剂量组大鼠海马MDA含量较模型组显著减低(P0.01)；黄芪甲苷组大鼠海马MDA含量较模型组也显著降低(P0.05)。结论：1.黄芪总苷及黄芪甲苷能够改善Aβ25-35诱导AD模型大鼠的学习和记忆能力。2.侧脑室注射Aβ25-35后,大鼠海马区域神经元密度明显减少,凋亡细胞明显增多,连续给予黄芪总苷及黄芪甲苷干预3周后,能够显著减轻Aβ诱导的神经元损伤。3.Aβ25-35诱导大鼠海马区域的氧化应激损伤,黄芪总苷能够显著增加抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性,降低海马组织MDA的含量,黄芪甲苷也能显著增加SOD活性,降低海马组织MDA含量,提示黄芪总苷及黄芪甲苷具有抗氧化以及保护大鼠海马区氧化应激的作用。综上所述,黄芪总苷及黄芪甲苷改善AD大鼠学习记忆功能和海马区神经元损伤,可能通过其抗氧化应激机制有关。第二部分黄芪主要有效成分对Aβ25-35诱导PC12细胞氧化应激的保护作用目的：黄芪为豆科黄芪属植物,其主要有效成分具有益气升阳、利水消肿等功效,具有显著的抗氧化作用。本研究选用神经元细胞株PC12细胞作为实验对象,采用Aβ25-35处理PC12细胞诱导氧化应激损伤,并检测黄芪主要有效成分黄芪总苷及黄芪甲苷是否对Ap诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,是否通过抑制Aβ诱导的氧化应激发挥作用。方法：1.以聚集态的Aβ25-35处理PC12细胞诱导神经损伤,建立体外模拟AD样损伤细胞模型。2.黄芪总苷及黄芪甲苷预处理后,观察药物处理对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用：(1)MTT法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞损伤的保护作用；(2)乳酸脱氢酶(LDH)法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞损伤的影响；(3) Hoechst 33342法观察黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞凋亡的影响；(4)流式细胞技术检测黄芪总苷及黄芪甲苷预处理对活性氧簇(ROS)平均荧光强度的影响；(5) ELISA法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞中抗氧化酶GSH-Px和SOD活性及氧化物MDA含量等的影响；(6)RT-PCR法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞iNOS mRNA的影响。结果：1.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞损伤的影响MTT法结果显示,不同浓度的黄芪总苷及黄芪甲苷(5、10、20、40、80、 100 μg/ml)对PC12细胞不产生毒性作用,也不影响细胞增殖。不同浓度聚集态AP25-35 (2.5、10、20、40μM24 h后,细胞存活率均明显下降,10 μM Aβ25-35作用24 h细胞存活率下降为65%,以此作为PC12细胞损伤的最佳作用浓度。黄芪总苷各浓度均能明显增加Aβ25-35诱导的PC12细胞存活率下降,与模型组相比,不同浓度黄芪甲苷5、 10、 20、40、80 μg/ml)均能显著增加PC12细胞存活率(P0.01)。LDH检测结果显示,10 μM Aβ25-35作用24 h PC12细胞上清液LDH释放明显增加,黄芪总苷(5、10、20、40、80 μg/ml)均能显著抑制上清液中LDH释放,黄芪甲苷(5、1O、20、40、80 μg/ml)也能明显抑制PC12细胞上清液中LDH释放·(P0.01)。2.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞凋亡的影响Hoechst33342染色结果显示,与对照组相比,10 μM AP25-35作用24 h后细胞内凋亡小体明显增加,核固缩现象明显；与模型组相比,黄芪总苷10、40μM预处理能明显减少细胞凋亡,核固缩现象明显减少,黄芪甲苷10、40μM预处理也能明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡3.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞氧化应激损伤的影响ELISA结果显示,与对照组相比较,10 μM Aβ25-35作用24 h后,PC12细胞内抗氧化酶GSH-Px和SOD活力明显下降(P0.01),黄芪总苷各浓度(5、10、20、40、80μM)均能明显增加GSH-Px和SOD活力,黄芪甲苷各浓度(5、10、20、40、80 μM)也能显著抑制GSH-Px和SOD的活力下降(P0.01)。Aβ25-35诱导PC12细胞MDA含量增加,与模型组比较,黄芪总苷预处理抑制PC12细胞损伤后MDA的释放,黄芪甲苷预处理也能显著降低MDA的含量(P0.01)。4.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞iNOS RNA表达的影响RT-PCR结果显示,10 μM Aβ25-35作用24 h诱导PC12细胞iNOS mRNA表达显著上调,与模型组相比,黄芪总苷(10、40μM)预处理均显著抑制PC12细胞iNOS mRNA表达,黄芪甲苷(10、40μM)也能明显降低PC12细胞iNOS mRNA表达(P0.01)。结论：Aβ25-35诱导PC12细胞活性明显降低,LDH释放增加,细胞凋亡和氧化应激增加。黄芪总苷及黄芪甲苷通过抑制PC12细胞活性降低和LDH释放增加,抑制细胞凋亡、氧化应激增加而发挥保护作用；Aβ25-35诱导PC12细胞iNOS表达上调也被黄芪总苷及黄芪甲苷所抑制。第三部分黄芪主要有效成分对H202诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用研究目的：为进一步验证黄芪主要有效成分黄芪总苷及黄芪甲苷的抗氧化作用,该部分旨在检测在神经元细胞株PC12细胞中,观察黄芪总苷及黄芪甲苷对H202诱导PC12细胞损伤的作用,并初步比较两者的抗氧化效果。方法：在体外培养的PC12细胞中,加入300 μM H2O2作用不同时间观察细胞活力的变化时相,确定H202损伤PC12细胞模型的最佳作用条件。给予黄芪总苷及黄芪甲苷预处理,采用MTT法和LDH检测反映PC12细胞存活率和LDH漏出率的变化,比较黄芪总苷及黄芪甲苷的作用效果差异。300 μM H2O2作用时间为4h时,细胞活力下降到约70%,故选取300 μM H2O2作用时间4 h作为建立H202损伤PC12细胞模型的适宜条件,用于后续试验。结果：300 μM H2O2处理PC12细胞后,随时间延长细胞活力逐渐下降,两者呈现正相关。MTT实验结果显示,与对照组比较,模型组细胞存活率显著下降；与模型组比较,黄芪总苷(10、20、40 μM)和黄芪甲苷(10、20、40μM)预处理能明显增加细胞存活率(P0.01)。LDH检测结果显示,H2O2作用4 h明显增加LDH的释放,与模型组比较,黄芪总苷(10、20、40μM)明显抑制H202诱导LDH释放增加；黄芪甲苷(10、20、40μM)也能明显抑制H202诱导LDH释放增加(P0.01)；与黄芪总苷比较,相同浓度的黄芪甲苷抑制LDH释放的效果更明显。结论：H2O2诱导PC12细胞活性明显下降,LDH释放增加,黄芪总苷及黄芪甲苷能显著抑制H2O2诱导的PC12细胞活性下降和LDH释放增加,表明对H2O2诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用。论文总结1.黄芪总苷及黄芪甲苷能够改善Aβ25-35诱导的AD大鼠的学习记忆能力。2.黄芪总苷及黄芪甲苷显著减轻Aβ25-35诱导的AD大鼠海马组织神经元损伤。3.Aβ25-35侧脑室注射降低海马组织的GSH-Px和SOD活性,上调海马MDA含量,黄芪总苷及黄芪甲苷预处理能够显著抑制GSH-Px和SOD活性降低和MDA含量增加。4.黄芪总苷及黄芪甲苷对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,并通过抑制细胞凋亡、氧化应激损伤发挥作用。5.Aβ25-35诱导的PC12细胞iNOS RNA表达上调,黄芪总苷及黄芪甲苷能够抑制iNOS RNA表达上调。6.黄芪总苷及黄芪甲苷对H2O2诱导的PC12细胞具有显著的保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285;R284

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