肝巨噬细胞Act1基因促进小鼠肝纤维化的初步研究

发布时间：2018-12-11 06:35

【摘要】：研究背景肝脏是我们人体最大的消化器官,也是我们人体维持正常生命的必须部分。正常生理情况下,肝脏具有解毒、合成蛋白质、贮存糖原、产生激素,降解红细胞、生成机体消化食物所需的物质(如胆汁)等作用。但肝脏同时也是各种疾病常常侵袭的器官,诸如代谢、中毒、微生物、循环障碍、病毒感染等均可造成肝脏的损伤。肝纤维化是多种慢性疾病如病毒性乙型肝炎、甲型肝炎、非酒精性肝炎、自发免疫性肝炎等通过一系列炎症反应导致肝脏组织内出现过多的细胞外基质(主要是胶原)沉积所致的一种病理改变。早期的肝纤维化可沿汇管区周围或中心静脉周围分布,随着纤维化的不断进展,胶原逐渐将肝脏分割成大小不一的结节,最终形成肝硬化、肝癌。目前肝纤维化、肝硬化、肝癌严重威胁着人类的健康,每年有27000人死于肝硬化。据估计肝硬化十年死亡率为34-66%。所幸研究表明,肝癌、肝硬化早期的肝纤维化在一定情况下是可以逆转的,但是肝硬化肝癌不容易逆转,因此找出肝纤维化的发病机制及成功逆转肝纤维化,可以挽救肝硬化肝癌病人。肝纤维化是许多慢性肝病共有的病理表现。目前认为,肝纤维化的形成是由于多种肝细胞损伤因子导致肝细胞损伤、坏死,继而引起肝组织炎症反应,激活kupper cell(KC),即肝巨噬细胞,释放多种细胞因子及炎症介质,这些细胞因子及炎症介质共同作用于静息状态下的肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell, HSC),使之激活、转化为成肌纤维细胞,通过旁分泌及自分泌的机制,使肌纤维母细胞增殖,形成大量的胶原和蛋白多糖等构成的细胞外基质,引起肝组织表型和功能上的改变。NF-κB,是一种多功能转录因子,广泛存在于人体的组织细胞内,许多炎性介质的表达都有赖于NF-K B,而不适当的刺激或NF-κB过度活化则与机体的多种炎症反应关系密切。研究发现,在哮喘的炎症反应中,多种炎性蛋白(IL-1 β,TNF-α、IL-10,TGF-β等)在转录水平上受到NF-κB的调控,NF-κB活化后它们的基因表达和蛋白分泌均增高。肝纤维化是肝脏对多种损伤因子激活炎症反应后修复不良所致,而如上述研究报道,NF-κB在炎症时能对多种细胞因子在转录上平上调控,因此,NF-κB与肝纤维关系密切。据报道用乙醇损伤动物的肝脏,可发现NF-κB的活性增强,其机制有可能是KC上的NF-κB被激活,活化后的NF-κB能够上调KC炎性介质(如TGF-β、TNF-、等)表达的作用,使KC细胞产生的炎性介质远远多于抗炎介质,而产生的炎性介质一方面作用于未活化的KC细胞中的NF-κB,产生更多的炎性介质,形成“炎性瀑布”,造成肝损伤,另一方面可迅速使HSC活化、增殖,最终形成肝纤维化。Act1是一个能够活化NF-κB的基因,是通过NF-κB依赖的筛选方法克隆得到的,也称之为TRAF3作用蛋白2 (TRAF3IP2)或CIKS (connection to IκB kinase and stress-activated protein kinases)。它表达于人体的骨髓、肺、肝脏组织等。Actl蛋白共有574个氨基酸,其相对分子量为60000,不含已知的酶结构域,N端是一个螺旋-环-螺旋区(HLH,135-190),C端有一个卷曲螺旋-卷曲螺旋(C-C,470-500)。它还含有两个TRAF (tumor necrosis factor receptor associated factor)连接区域(EEESE,38-42基团；EEERPA,333-337基团)和一个SEFIR(similar expression to fibroblast growth factor genes and IL-17Rs)·(394-574基团)区域。Actl尚存在一个缺乏外显子2编码的前9个氨基酸的剪接体,研究证明Actl的剪接体具有激活NF-κB和急性期反应蛋白(AP)-1的功能,在炎症和免疫损伤中发挥着重要作用。Actl对NF-κB的活化主要是通过两个TRAF与TAK1, NIK或者类NIK蛋白以及IKK信号通路的信号分子相互来发挥作用。在肝纤维化形成的过程中,TGFβ1-Smad3是促进肝纤维化的主要信号通路。巨噬细胞释中NF-κB可以上调TGFβ1的表达,激活HSC, HSC合成胶原,纤维蛋白及蛋白多糖,并抑制基质金属蛋白酶合成,促进HSC分泌组织金属蛋白酶抑制剂和PAI-1等减少细胞外基质降解。其传导过程为：TGFβ1活化后与TGFβⅡ型受体结合,形成异二聚体,随即被Ⅰ型受体识别组合成受体异聚体复合物,异聚体复合物中的工型受体被Ⅱ型受体磷酸化,磷酸化的工型受体将信号放大并进一步磷酸化胞浆中的Smad3,磷酸化的Smad3与Smad4分子形成Smad复合物并进入细胞核内与靶基因结合调控其转录和表达。综上所述,肝巨噬细胞参与了肝纤维化的形成,而肝巨噬细胞中NF-κB上调TGF-β1促进肝纤维化的发生。且最近研究表明,选择性去除肝中的巨噬细胞可减轻肝纤维化的发展。但是并没有文献表明选择性的沉默肝巨噬细胞上Act1基因对肝纤维化形成的影响。考虑到Act1基因是NF-κB的激活因子,且肝巨噬细胞的NF-κB参与肝纤维化的发展,因此本课题假设肝巨噬细胞Act1基因沉默可能通过降低NF-κB的磷酸化水平从而下调TGF-β1/smad3的表达,最终减轻肝纤维化的形成。目的本研究旨在通过检测肝巨噬细胞Act1基因及NF-κB、TGFβ1、Smad3在肝纤维化中的表达变化和相互联系,初步探讨肝巨噬细胞Act1基因在肝纤维化中的作用,为肝纤维化的诊断和临床治疗提供新思路及方向。方法1.鉴定anti-Act1(即肝巨噬细胞Act1基因沉默)转基因小鼠剪取小鼠尾部组织1cm,提取DNA,采用琼脂糖凝胶电泳方法,按照目的条带的大小鉴定出anti-Act1转基因小鼠。采用免疫组化方法及免疫荧光的方法,检测肝巨噬细胞上Act1基因的表达及沉默。2.CCl4诱导C57和anti-Act1转基因小鼠肝纤维化模型的建立将6-8周龄anti-Actl转基因小鼠及其背景小鼠C57,均按2ml/kg体重腹腔注射橄榄油溶剂和CCl4溶液(4：1),每周注射2次,注射6周,比较各组肝脏的纤维化程度；3.总胆管结扎anti-Actl和C57转基因小鼠诱导肝纤维化模型的建立将6-8周龄C57和anti-Actl转基因小鼠随机分为胆总管结扎组(bile duct ligation,BDL)和假手术组(sham).结扎组小鼠腹部皮肤常规消毒,沿腹正中线剪开,暴露胆总管,将胆总管远、近端结扎3次,缝合腹部。假手术组仅开腹并游离胆总管而不结扎,随后缝合腹部。两周后,小鼠麻醉并收集血液和肝脏标本。4.C57/olive,C57/CCl4,anti-Actl/ol1ive,anti-Actl/CCl4,C57/sham, C57/BDL,anti-Actl/sham,anti-Actl/BDL组小鼠肝纤维化程度通过HE、天狼猩红染色,免疫组化染色方法分别观察各组肝组织结构、肝脏胶原纤维含量,比较肝纤维化的严重程度。5.C57/olive,C57/CCl4,anti-Actl/olive,anti-Actl/CCl4,C57/sham, C57/BDL,anti-Actl/sham,anti-Actl/BDL组肝损伤的程度。采用ALT,AST,HYP检测试剂盒,运用酶标仪读取数值,比较各组肝损伤的程度。6.C57/olive,C57/CCl4,anti-Actl/olive,anti-Actl/CCl4,NF-κB(P65)及TGFβ1、Smad3相关蛋白表达检测采用Western blot检测各组肝组织中P65、TGFβ1、p-Smad3的表达。7.肝纤维化程度判断标准按照Ishak Stage标准,小鼠肝纤维化分为6期：“0”无纤维增生；“1”一些汇管区生成纤维,有或者无短的纤维间隔；“2”大多数汇管区生成纤维,有或者无短纤维间隔；“3”大多数汇管区生成纤维,门管区之间偶尔有纤维连接；“4”汇管区生成纤维,门管区之间形成明显的纤维连接；“5”门管区之间形成大量明显的纤维连接,可见纤维结节；“6”大量的纤维结节形成。8.统计学处理所有数据均使用Graphpad4.0统计软件进行统计分析。多组间比较采用ONE WAY ANOVA分析,两组间比较采用t检验,结果用均数±标准差表示,P0.05具有统计学差异。结果1.成功鉴定并检测肝巨噬细胞Act1的表达及沉默按照上海中科院构建的anti-Actl转基因小鼠确定的条带位置为250bp,我们的琼脂糖凝胶电泳上的条带位置与之一致。免疫组化及免疫荧光提示,Act1基因表达于正常的肝组织巨噬细胞上,而沉默Act1基因后,肝巨噬细胞上不表达Act1。2.成功构建CCl4/BDL诱导的肝纤维化模型HE染色及天狼猩红染色结果显示C57/CCl4, C57/BDL, anti-Actl/CCl4, anti-Act1/BDL小鼠的肝组织中见胶原纤维沿汇管区分布,C57/ol ive和anti-Act1/olive,C57/sham和anti-Actl/sham小鼠肝脏未见胶原纤维沉积。3. 肝巨噬细胞Act1基因促进肝纤维化形成HE,天狼猩红染色及免疫组化检测发现,C57/CCl4,C57/BDL组肝中的胶原纤维含量明显高于anti-Actl/CCl4, anti-Actl/BDL组,且P0.05,差异具有统计学意义。而C57/olive和anti-Actl/olive与C57/sham和anti-Actl/sham＼鼠没有统计学差异。4. NF-κB、TGF-β1/Smad3参与了肝巨噬细胞Act1基因介导的肝纤维化形成Western免疫印迹发现,C57/CC14中的p65,TGF-β1及Smad3表达高anti-Act1/CCl4,, C57/olive和anti-Act1/olive小鼠组TGF-β1及Smad3无变化。P0.05,差异具有统计学意义。结论1.肝巨噬细胞Actl基因促进肝纤维化的形成及进展。2.靶向沉默肝巨噬细胞Actl基因通过降低NF-κB的磷酸化水平从而下调TGF-β1/Smad3的表达,最终减轻肝纤维化的形成。创新点靶向沉默肝巨噬细胞Actl基因通过降低NF-κB的磷酸化水平从而下调TGF-β1/Smad3的表达,最终减轻肝纤维化的形成,为肝纤维化发生机制及治疗靶点提供新理论;
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2

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