微弧氧化载银处理的Ti6Al4V钛合金对人牙龈成纤维细胞生物学行为的影响

发布时间：2019-01-04 19:44

【摘要】：临床上种植义齿在缺失牙患者的治疗中适应证广泛,近几十年种植义齿更是迅速发展,越来越多的缺牙患者开始选择种植义齿修复,种植学也成为了口腔学科中发展最为迅速的二级学科,种植义齿的出现甚至改变了传统的缺牙修复治疗模式。种植体周围炎(又称种植体周围黏膜炎)是指发生在口腔种植体周围软组织的可逆炎症。其发生发展的根本因素是寄生在种植体上的细菌微生物。由于口腔卫生不良,种植体周围菌斑堆积,从而刺激机体产生炎症反应。临床上患者表现为黏膜的红肿、探诊出血甚至溢脓等症状。其一般发生在种植体植入之后或行使功能之后,发生于种植体周围组织的慢性炎症,多导致种植体周围支持骨吸收,其发展的最终归宿是种植体脱落。良好的骨整合与种植体颈部良好的软组织附着所形成的“袖口”封闭是维持种植体长期稳定的生物学基础,是抵抗种植体周围炎的关键。“袖口”结构的形成,可以起到生物学屏障作用,能够有效阻止细菌及其他致炎因子的入侵,预防种植体周围炎的发生,减少骨组织吸收,提高临床种植义齿成功率。本实验意在探讨一种更有利于牙龈成纤维细胞附着的愈合基台表面处理方法,为愈合基台一种表面临床改良提供可行的实验依据。种植体可以长期稳定存在于口腔环境并良好的行使作用,“骨结合”必不可少,其中种植体穿龈部分也起着至关重要的作用。虽然种植体周围结合上皮和天然牙周围结合上皮类似,以半桥粒与基底板附着在种植体表面,但是种植体和结缔组织的结合方式一直存在着争议。牙龈结缔组织里牙龈成纤维细胞占最主要作用,本实验拟研究微弧氧化处理和微弧氧化载银处理的Ti6Al4V合金对牙龈成纤维细胞的生物学行为的影响,引导我们探索一种有利于袖口形成的愈合基台的表面处理方法,具有一定临床意义。第一章人牙龈成纤维细胞的培养及鉴定目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblasts, HGFs),观察人牙龈成纤维细胞体外培养的形态特点,对其来源进行鉴定,为接下来的实验提供细胞基础。方法:选择就诊于南方医科大学南方医院正畸科且需要拔牙进行矫正治疗的年轻患者,年龄12～20岁,要求患者牙龈健康、无龋齿、无牙龈增生且未服用可使牙龈增生的药物。征得其同意并签署知情同意书后局部麻醉下拔除正畸牙同时切取牙龈组织,采用酶消化组织块法对其进行原代培养,并通过免疫组织化学染色对其来源进行鉴定。结果:1.显微镜下可观察到原代细胞在培养到第3-5d左右时从黑色组织块边缘向四周游出,细胞紧贴培养瓶壁生长,细胞形态多呈长梭形,胞体丰满,胞浆均匀,可见到单颗细胞核位于胞浆中央呈椭圆形,其内可见含2-3个核仁。伴随培养天数的增加,细胞从组织块中央向四周伸展,以组织块为中心呈现放射状排列,排列紧密,细胞呈极性排列。到观察到细胞长满培养瓶底约90%面积左右时可看见HGFs胞体排列紧密呈细长梭形,细胞排列呈旋涡状与编织状,传代培养后的牙龈成纤维细胞生长旺盛,上皮细胞逐渐消失,性状趋于稳定。2.在光镜下对细胞行免疫组化染色观察,细胞表现出抗波形丝蛋白染色阳性,胞质内阳性颗粒分布均匀,胞核清晰、无染色;抗角蛋白染色阴性,证明细胞来源于中胚层,且无上皮源性细胞混杂。阴性对照组均未见阳性染色结果。说明我们培养的细胞来源于间充质而非上皮源性细胞。结论:本实验通过组织块法成功培养出HGFs,并通过免疫组织化学对其进行了鉴定,这些细胞增殖能力较强,可以在体外维持较长时间,足以满足本接下来研究所需。第二章微弧氧化与微弧氧化载银处理的Ti6Al4V钛合金理化性能的研究目的:使用扫描电镜(SEM)、表面元素分析仪、表面粗糙度仪、接触角测量仪检测微弧氧化与微弧氧化载银处理后的Ti6Al4V钛合金表面形貌特点、元素组成、表面粗糙度水平和表面接触角大小水平。方法:购置8mm直径、0.8mm厚度的Ti6Al4V合金片;以Ti6Al4V钛合金作为阳极,铂电极作为阴极,采用350V恒压,设置频率50Hz,设置占空比50%,在冰块冷却作用下使电解液温度保持在在40℃以下处理5min。试样经微弧氧化后用去离子水超声洗涤15min,放入烘干箱,烘干干燥纸塑密封包装备用。配制为0.006mol/L浓度硝酸银溶液作电解液,铂电极作为阳极、微弧氧化处理后的试样作作为阴极,硝酸银溶液做电解液,设置2V电压使试样在电解液中处理30s,对钛合金片作电沉积载银处理(处理过程中均匀搅拌电解液),超声清洗后干燥,得到载银微弧氧化试样。使用扫描电镜(SEM)观察处理后试样表面形貌、结构;使用表面元素分析仪分析处理后试样表面元素组成;使用表面粗糙度测量仪测量试件表面糙度,测量处理试样表面液体接触角并计算材料表面自由能。结果:扫描电镜观察微弧氧化后钛合金片表面,可观察到粗糙多孔氧化陶瓷,呈“火山口 ”形貌,“火山口”孔径约2-5μm。检测Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag表面粗糙度得知粗糙度为微米级。进行表面接触角检测,发现Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag组均小于光滑组。结论:经微弧氧化与微弧氧化载银处理后的Ti6Al4V合金表面形成了“火山口”状特殊形貌,其粗糙度加大,处理后所表面水接触角更小,表面元素及元素比例发生变化。第三章微弧氧化Ti6Al4V钛合金载银对人牙龈成纤维细胞早期黏附、细胞形态及增殖的影响目的:研究微弧氧化Ti6Al4V钛合金载银对人牙龈成纤维细胞早期黏附、细胞形态及增殖的影响。方法:于光滑的Ti6Al4V钛合金,Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag表面分别接种原代培养的人牙龈成纤维细胞,通过扫描电镜、CCK-8、荧光正置显微镜等方法检测观察HGFs的早期黏附、增殖情况及细胞形态。结果:1.细胞早期黏附:在光滑Ti6Al4V钛合金、Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag表面分别接种人牙龈成纤维细胞细胞,接种细胞12h,24h后用DAPI染料及荧光抗体分别对其细胞核与细胞骨架进行染色处理,荧光显微镜下计算细胞个数。12h,24h后Ti6Al4V-MAO组以及Ti6Al4V-MAO-Ag组表面细胞数量明显多于光滑组,有统计学差异(P0.05)。2.细胞形态:荧光正置显微镜下观察经荧光染色处理的HGFs接种在光滑Ti6Al4V钛合金、Ti6Al4V-MAO组与Ti6Al4V-MAO-Ag组表面12h后的细胞架形态变化,发现牙龈成纤维细胞在光滑钛合金表面沿着抛光试样时的纹路排列,呈梭型排开,细胞呈现出极性排列方式。而Ti6Al4V-MAO与Ti6Al4V-MAO-Ag组表面细胞呈纺锤型生长,细胞铺展面积较大。扫描电镜观察可见在牙龈成纤维细胞与试样恒温共培养12h之后细胞延材料表面砂纸打磨痕迹单向极性伸展,呈梭型与条状。而MAO与MAO-Ag组共培养牙龈成纤维细胞伸出伪丝和丝状伪足。继续培养至24h后可见到光滑组细胞有多方向伸展变化,MAO与MAO-Ag组牙龈成纤维细胞伸展面积明显增大。3.细胞增殖:使用CCK8法检测HGFs接种在对对照组、光滑组、MAO组以及MAO-Ag组表面1d、3d、5d、7d后的细胞增殖数量,发现培养1d时,各组的细胞增殖数量变化不明显。但培养3 d、5 d、7 d后MAO组以及MAO-Ag组材料表面的细胞数量明显多于光滑组,且有统计学差异。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.6

【参考文献】