甲状旁腺激素PTH（1-34）对小鼠肺癌骨转移瘤生长的影响

发布时间：2019-01-12 19:04

【摘要】：背景：骨转移癌是晚期肿瘤常见的并发症之一。临床上以肺癌、乳腺癌、前列腺癌、等实体瘤最易出现骨转移,占肿瘤骨转移的85%[1]。原发性肺癌骨转移占晚期肺癌患者的30-40%[21,主要分布在肋骨、脊柱、骨盆以及四肢骨等部位。绝大部分为溶骨性破坏,少数呈成骨性破坏。由于骨质和骨膜破坏,常造成局部疼痛,骨和关节运动障碍,病理性骨折,高钙血症,从而使患者生存期的生活质量明显下降,原发性肺癌骨转移患者的中位生存时间约为8-10个月[3]。目前在于骨转移癌病人的治疗上面仍无显著有效的方案,多采用综合治疗方法,包括全身性化疗、局部放射、内分泌治疗及放射性同位素等,均是针对肿瘤细胞的作用。而对骨质起作用药物甚少的,仅有双麟酸盐用于抑制破骨细胞而起到治疗作用,有学者研究双磷酸盐能抑制破骨细胞,干预肿瘤细胞对骨的侵犯,减轻肿瘤引起的骨损伤[4]。目前用于促骨形成药物PTH(1-34)具有良好的促骨形成作用,同时能改变骨微结构。是否可以利用其促骨形成作用而延缓骨转移癌对骨破坏,从而延缓病理性骨折的发生呢? 甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone, PTH)是一种促骨形成药物[5],2002年美国FDA批准上市,2010年PTH(1-34)批准进入中国。已经有大量研究表明间断小剂量注射PTH(1-34)可明显增加骨密度、改善骨微结构、降低骨折风险[6,7]。目前PTH(1-34)已经广泛应用于临床,主要用来治疗骨质疏松症[8,9]。天然的PTH由84个氨基酸构成(PTH(1-84)),与I型PTH受体(PTHR1)结合,N端的34个氨基酸残基(PTH(1-34))具有与PTH(1-84)相同的PTHR1结合和激活功能。研究表明PTH调节成骨细胞的生成、转化、增殖或凋亡等各个环节[10],对破骨细胞的作用是通过对成骨细胞的影响而间接达到的,其效应受体是成骨细胞表面的Ⅰ型PTH受体(PTHR1)[11],从而激活PTHR1及其下游的多个信号途径而实现对骨的调节。因此能否将PTH(1-34)应用于骨转移癌病人,利用PTH(1-34)的促骨形成及对骨结构的重建的作用,延缓病理性骨折发生,甚至延长病人生存时间,成为我们实验的初步思路,而实现这个思路,建立一种动物模型是我们试验的基础。动物模型的制备是肿瘤骨转移的基础,而骨转移癌的动物模型,常用已建立的人/动物肿瘤细胞株种植于免疫缺陷动物体内而建立的。小鼠是公认的药物检验最佳动物选择,目前关于小鼠骨转移模型成熟,从其制作方法常分为三种：第一种通过血流播散制作的肿瘤骨转移模型1、静脉注射法：静脉注射法与临床上骨转移产生机制不符,以前很少使用。但最近Teresa等[12]报道,将MDA-MB-231细胞株在裸鼠体内连续多次传代后,筛选出多株不同细胞克隆,给这些细胞克隆转染荧光素酶报告基因,通过活体成像技术发现,B02克隆株与其它细胞克隆不同,该细胞株具有快速形成溶骨型骨转移的能力。实验发现将B02通过小鼠尾静脉注射后,10天即可形成明显的骨转移。2、心脏注射法：左心室注射法产生的骨转移模型与肿瘤患者骨转移灶无论在生长状况还是形态学上都非常相似,是目前最常用的方法之一。该模型不仅有许多优点,还符合Paget提出的“种子与土壤学说”:肿瘤细胞充当“种子”,骨髓腔微环境充当“土壤”。支持该学说的证据有：肿瘤细胞经左心室注射后,一些细胞在骨微环境中选择性生长进而形成骨转移瘤；抑制溶骨反应可以抑制转移肿瘤的生长。利用该方法制备的模型的缺点是引起脑、肺、肾上腺皮质等的多发性转移,还可造成某些实验鼠骨转移尚未出现而因其它的转移灶致死。第二种方法,局部骨内注射制作骨转移模型,该法将针尖直接刺透骨皮质,将移植肿瘤细胞注入胫骨或股骨的骨干。具有致瘤率高、制作方法简单、不受脏器转移影响等优点。缺点是造成了骨皮质和骨髓腔的损伤,且所制作的模型主要为骨干转移,与临床上常见的骨骺端转移不同。骨内注射方法常被用来制作成骨性或成骨/溶骨混合性骨转移模型[13]。为研究骨转移发生机制和药物疗效提供了一个极具价值的模型工具。第三种方法,肿瘤原位移植模型,原位移植是指将癌细胞或组织块种植于小鼠胸壁的乳腺脂肪垫内或前列腺组织从而发生骨转移。用该方法形成的骨转移模型保留了从肿瘤原发灶到骨转移的完整过程,但该复制方法也存在缺点,即与上述介绍的血流播散、骨内注射等方法相比,骨转移的发生率偏低,且伴有其他脏器的转移。因此若从成瘤高,瘤体容易观察,不易受器官转移影响方面考量,那么第二种动物模型制备的方法适合应用。本研究在上述背景下,选择建立小鼠肺癌骨转移模型,并在此模型上间歇性小剂量皮下注射PTH(1-34),通过观察小鼠全身X线、显微CT、骨组织病理切片、血清ALP等指标,初步观察PTH(1-34)对小鼠肺癌骨转移瘤生长的影响。目的建立肺癌骨转移小鼠模型；初步观察甲状旁腺激素PTH(1-34)对肺癌骨转移瘤的影响。方法将30只4-6周龄BALB/c雌性小鼠,用人肺癌A549细胞悬液骨内注射的方法制作胫骨近端肺癌骨转移模型,7天后X线确定模型建立,随机分成三组,一组注射甲状旁腺素PTH(1-34)作为观察组,一组注射等量溶解剂作为空白对照组,一组注射环磷酰胺作为阳性对照组,每2天测体重一次及观察右后肢瘤体生长情况,给药28天后处死小鼠,所有小鼠行X线及显微CT检查观察肿瘤形态、大小,CT检测胫骨局部骨密度及肿瘤体积,HE染色及免疫组织化学法观察肿瘤形态及性质,检测血清碱性磷酸酶浓度了解成骨情况。所有数据均以均数±标准差(x±SD)表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析,ALP、肿瘤体积及CT数据分析采用单因素方差分析做整体检验,两两比较采LSD-t检验,P0.05被认为差异有统计学意义。结果 1、荷瘤小鼠成模情况：本组造模小鼠30只,经7天后X线检查,全部成瘤。 2、三组小鼠体重的变化：在造模后35天的观察期内,与对照组比较,观察组小鼠体重在用选模后14天内有轻度下降,后随时间增长逐渐增加,在造模21天后保持与对照组一至,环磷酰胺组在造模后14天内体重也轻度下降,后体重增长缓慢,在造模后35天时略低于对照组及实验组。(图2) 3、血清中ALP活性水平：三组小鼠间血清基线相比,各组的ALP水平均有明显升高,PTH(1-34)组ALP升高幅度大于对照组,两组间差异有显著性(p0.05), PTH (1-34)及对照组升高幅度均明显大于环磷酰胺组,组间差异有显著性(p0.05)。(图3) 4、X线表现：三组均存在骨破坏,观察组与对照组骨破坏严重,均见溶骨性破坏,胫骨近端明显,其中对照组1只小鼠左胫骨骨折,而环磷酰胺组骨破坏明显较轻,其中6只小鼠骨皮质完整,肿瘤影响明显小于前两组。(图4) 5、显微CT表现：观察组及对照组均存在胫骨平台骨中度及重度的破坏,呈明显的溶骨性表现,皮质破坏,髓腔充满癌组织,大部分骨小梁消失。与临床上肺癌骨转移的表现是一致的[14],环磷酰胺组骨破坏轻到中度,部分骨皮质仍完整,抑制骨肿瘤生长明显优于观察组及对照组(图5)。利用CT软件检测骨肿瘤的体积(图5),发现PTH(1-34)与对照组的骨肿瘤体积大小之间的差异无显著性(p0.05),而两组骨肿瘤的体积明显大于环磷酰胺组,组间差异显著(P0.05),提示PTH(1-34)不抑制转移瘤的生长,但也并没有促进骨转移瘤体积增长的趋势。检测胫骨近端肿瘤灶局部骨密度(图7),从Mean/Density of BV及BV/TV两方面数据提示PTH(1-34)组骨密度大于对照组,组问差异有显著性,(p0.05),两组骨密度降低幅度均明显大环磷酰胺组,组间差异显著(p0.05)。结论 1、人肺癌A549细胞可以在BALB/c小鼠身上成功建立胫骨近端转移癌模型,胫骨平台下癌细胞悬液注射法的成瘤时间、大小一致,成瘤率高(本组100%),是研究肿瘤发生、发展、转移等机制的较理想的动物模型。 2、ALP是促骨形成生化指标,X线扫描,显微CT扫描及骨组织病理切片是检测肿瘤骨转移的良好指标： ①碱性磷酸酶(ALP)是评价骨形成的一个敏感指标[15],三组小鼠造模后,转移的肿瘤细胞破坏骨质将刺激成骨细胞增殖对其修复导致ALP升高,而观察组使用小剂量PTH(1-34)进一步刺激成骨细胞,进一步促进骨形成。 ②X线能观察小鼠骨质结构的整体情况,能在麻醉下进行活体X线扫描,利于在造模后不同时间点(造模1周及5周)对模型肿瘤照片观察,早期用于观察造模是否形成,后期能明确判断下肢整体肿瘤生长及破坏影像。 ③显微CT扫描清晰显示骨肿瘤形态,骨质破坏,骨小梁结构及髓腔浸润情况,三维重建更直观显示肿瘤大小、形状、范围；利用CT自带软件测量肿瘤长、短径,通过公式体积=长径×短径2计量肿瘤大小,能进行肿瘤大小的比较及组间差异分析；分析Mean/Density of BV及BV/TV的数据,BV及BV/TV是指示骨量及骨分数的指标,组间两两比较,说明组间的差异,表示局部骨量差异的情况。 ④病理学提示骨质破坏、肿瘤细胞情况,免疫组化分辨肿瘤性质,区分原肿瘤或新生肿瘤。 3、综合上述理论及结果数据,我们得出这样的结论,间断小剂量注射甲状旁腺激PTH(1-34)并不促进小鼠肺癌骨转移瘤的生长,但能增加转移瘤灶周围的骨量。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R738.1;R734.2

【参考文献】