【摘要】：研究背景和目的发育期神经元处于兴奋与抑制的不平衡状态。在发育期神经系统,GABA作为一种兴奋性神经递质在发育期神经元生长及突触形成中发挥着重要的作用。在这种缺乏抑制性神经递质的状态下,并没有导致发育期神经元产生病理性改变,相反可以促进发育期神经元生长及可塑性,究其原因可能与NMDA受体的发育期特点有关。在海马所在的前脑区,NMDA受体NR2A/NR2B比例会随个体发育而升高,而LTP和LTD诱导的难易程度也随之发生变化,提示了NR2A/NR2B比例可能影响脑的发育和突触可塑性的形成。NMDA受体亚单位随着神经元发育及活动依赖性转变。研究表明NMDA受体亚单位从发育期NR2B到成熟期NR2A转变受到PKA、PKC、及CK2等激酶的调节。NR2B受体是防止发育期神经元过度兴奋性损伤的天然屏障。在发育期神经元,突触后膜主要表达NR2B受体。出生后,随着神经元的发育生长,NR2B受体逐渐被NR2A受体取代。通过磷酸化NR2B受体,导致NR2B受体胞吞和NR2A受体插入突触后膜,突触发育成熟。Cdk5的调节激动剂p35,是一种大脑特异性的钙蛋白酶作用底物,Cdk5和p35都是维持大脑发育和存活的重要通道蛋白。谷氨酸盐激活原代神经元中的NMDAR,可以激发钙依赖性-钙蛋白酶介导的p35蛋白水解为更小分子量的p25,部分程度上因为Cdk5的异常激活和靶向重置而诱导神经元凋亡。因此,在这些神经元中,抑制钙蛋白酶或Cdk5可以阻止p25介导的神经元损伤。需要指出的是,经历某些形式的非兴奋毒性损伤的神经元同样需要钙蛋白酶介导产生的p25,提示钙蛋白酶抑制剂的治疗潜力不仅局限于神经元兴奋毒性损伤。与其在兴奋毒性中的重要角色相一致的是,在局部缺血性脑卒中和全大脑缺血的小鼠模型的大脑中,以及阿尔茨海默病患者和缺血性中风患者脑组织样本中,p25表达是增加的。重要的是,转基因小鼠前脑中p25的过表达会触发神经退行性变,抑制Cdk5或它的下游目标基因,可以阻止由p25和脑缺血引起的神经元损伤。尽管有很多蛋白是Cdk5的磷酸化底物,p25诱导的神经元损伤被证明是由Cdk5介导的NMDAR的GluN2A亚单位磷酸化、肌细胞增强因子2和抗氧化剂酶Prx2和无嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶的磷酸化和抑制以及组蛋白脱乙酰酶的抑制所引起。本实验室最近研究证实吸入麻醉药剂量依赖性易化发育期神经元电压依赖性钙通道(Voltage dependent calcium channels,VDCC)和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体,增加神经元内自由钙离子浓度,导致明显的毒性反应。对吸入性全身麻醉药致发育神经元突触可塑性及其机制进行深入研究,并探索有效的防治手段,对指导临床安全使用吸入性全身麻醉药显得尤其重要。本实验拟证实以下几个假设：1.异氟烷通过改变NMDAR磷酸化程度和其亚型比例,影响发育期神经元形态和功能。2.异氟烷通过CK2-CDK5-p35通路影响NMDAR受体构成及功能。3.临床相关浓度异氟烷对发育期大鼠远期学习记忆功能并无显著影响。研究方法和结果1.测定吸入异氟烷前后海马神经元NMDA受体亚单位表达的变化选择同窝出生5天SD大鼠,随机分组,处理组在相同条件下分别吸入相同浓度异氟烷(MAC 1.3)2、4、6小时,对照组吸入空气,24小时之后处死大鼠并分离海马组织。利用Western Blot方法,检测吸入麻醉药干预前后海马神经元NR2A和NR2B蛋白表达变化及S1480位点磷酸化程度的改变。结果：临床相关浓度异氟烷(Mac 1.3)呈剂量依赖性降低NR2B的Ser1480位点磷酸化,减少细胞膜上的NR2B表达(P0.05),而NR2B总表达量和NR2A表达无显著变化。异氟烷吸入4小时组海马神经元的NR2B-PSD95复合物比对照组显著减少(P0.05)。这也证明了NR2B的Ser1480位点磷酸化能破坏NR2B与PSD95的结合,并减少细胞膜表面的NR2B表达,导致NR2B向胞内运输。2.异氟烷对发育期海马神经元CK2信号通路的影响选择同窝出生5天SD大鼠,随机分组,处理组在相同条件下分别吸入相同浓度异氟烷(MAC 1.3)2、4、6小时,对照组吸入空气,24小时之后处死大鼠并分离海马组织。采用Western Blot方法,检测海马神经元CK2、p35、p25的蛋白水平表达变化。结果：临床相关浓度异氟烷呈剂量依赖性降低CK2表达,增加p35、p25蛋白水平表达(P0.05)。3.异氟烷对发育期海马神经元凋亡及Caspase-3表达的影响选择同窝出生5天SD大鼠,随机分为对照组、异氟烷吸入组、异氟烷+Minocycline组,异氟烷+Minocycline组大鼠麻醉前12小时预先给予Minocycline腹腔注射45mg/kg处理,后两组在相同条件下分别吸入相同浓度异氟烷(MAC 1.3)4小时,对照组吸入空气,24小时之后处死大鼠,取出完整大脑组织制作海马区冰冻切片。免疫荧光法检测海马神经元Caspase-3活性细胞数量的变化。结果：异氟烷吸入组的Caspase-3活化细胞数量显著大于对照组(P0.05),而加入抑制剂Minocycline的组Caspase-3活化细胞数量和对照组无明显差异。4.CDK5抑制剂Roscovitine对异氟烷吸入处理后大鼠海马神经元NMDAR表达的影响选择同窝的出生5天SD大鼠,随机分成对照组,Roscovitine组,异氟烷处理组,异氟烷+Roscovitine组。其中Roscovitine组和异氟烷+Roscovitine组的大鼠预先给予Roscovitine。在35℃温箱中,异氟烷处理组和异氟烷+Roscovitine组分别吸入相同浓度异氟烷(Mac 1.3)达4小时,氧流量1L/min;对照组和Roscovitine组吸入空气,24小时之后处死大鼠,分离海马组织并提取蛋白。采用Western Blot法检测各组大鼠海马神经元NR2B、p-NR2B (S1480)蛋白水平表达变化。结果：与对照组相比,异氟烷处理组中,细胞膜上NR2B、p-NR2B (Ser1480)表达减少而向胞浆中转运：而异氟烷+Roscovitine组相比异氟烷组,膜上的NR2B蛋白及磷酸化表达明显增多(P0.05)。对照组和Roscovitine组中这两种蛋白表达无明显差异。5.CDK5抑制剂Roscovitine对异氟烷吸入后海马神经元CDK5-p35-CK2信号通路的影响选择同窝的出生5天SD大鼠,随机分成对照组,Roscovitine组,异氟烷处理组,异氟烷+Roscovitine组。异氟烷处理组和异氟烷+Roscovitine组分别吸入相同浓度异氟烷(Mac 1.3)达4小时,氧流量1L/min;对照组和Roscovitine组吸入空气,24小时之后处死大鼠,分离海马组织并提取蛋白。采用Western Blot法检测各组大鼠海马神经元CK2、p35/p25蛋白水平表达变化。结果：异氟烷组中CK2较之对照组和Roscovitine组表达明显减少,p35/p25表达增加(P0.05)；异氟烷+Roscovitine组CK2的表达比异氟烷组明显增多,与对照组无显著差异。6.CDK5抑制剂Roscovitine处理异氟烷吸入的大鼠海马各区域p-NR2B (S1480)表达变化选择同窝的出生5天SD大鼠,随机分成对照组,Roscovitine组,异氟烷处理组,异氟烷+Roscovitine组。异氟烷处理组和异氟烷+Roscovitine组分别吸入相同浓度异氟烷(Mac 1.3)达4小时,氧流量1L/min;对照组和Roscovitine组吸入空气,24小时之后处死大鼠,分离新鲜脑组织并制作海马区的冰冻切片。运用免疫组化法观察大鼠海马DG区、CA1区、CA3区神经元p-NR2B(S1480)表达数量的变化。结果：免疫组化切片显示,与对照组、Roscovitine组相比,异氟烷组大鼠海马CA3区神经元NR2B的Ser1480位点磷酸化的细胞数量明显减少(P0.05), CA1、DG区无明显差异;异氟烷+Roscovitine组各区海马神经元磷酸化数量与对照组相比无明显差异。7.远期学习记忆行为学测试选择同窝出生5天SD大鼠,随机分成处理组和对照组,处理组在血氧饱和度监测下分别吸入相同浓度异氟烷(MAC 1.3)2小时、4小时、6小时,对照组吸入空气,然后在相同生存环境下继续饲养至成年(8周),采用Barnes Maze行为学测试方法检测其空间学习记忆功能。结果：测试第5天和第12天,6h组大鼠比对照组、2h组、4h组大鼠进入目标洞的潜伏期均明显增长(P0.05),错误次数无明显差异。统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组内比较采用one-way ANOVA方差分析,组间比较采用配对t检验,P0.05为差异有统计学意义。研究结论和总结一、主要研究结果1.5天龄大鼠吸入不同时间的临床相关浓度异氟烷,证实了其剂量依赖性通过改变NMDAR磷酸化程度和其亚型比例,影响发育期神经元形态和功能。2.通过在体大鼠吸入异氟烷,证实其通过CK2-CDK5-p35通路影响NMDAR受体构成及功能。3.成年后大鼠行为学实验提示小剂量的临床相关浓度异氟烷对发育期大鼠远期学习记忆功能并无显著影响。二、研究结论1.吸入麻醉药异氟烷通过下调CK2,过度激活CDK5-p35而磷酸化大鼠发育期神经元中NR2B的Tyr1472位点,引起NR2B向胞内运输；下调NR2B的Ser1480位点磷酸化,破坏NR2B与PSD95的结合,并减少细胞膜表面的NR2B表达。以上两方面同时导致NR2B提前转变为NR2A,致发育期神经元生长、突触形成及可塑性的改变,而这一过程可通过抑制CDK5而达到降低异氟烷神经元兴奋性毒性的作用。2.成年后SD大鼠Barnes Maze行为学测定空间学习记忆功能方面的实验结果,表明吸入临床相关浓度异氟烷适当时间内对发育期神经元远期神经毒性尚不明显。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R614
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