氧浓度及去铁胺对大鼠髓核细胞生物学行为影响

发布时间：2019-01-27 07:59

【摘要】：研究目的椎间盘细胞生活在一个低氧的微环境中，低氧张力是调节髓核细胞增殖分化和细胞外基质合成的重要因素。Notch信号通路是一个对低氧敏感、调节细胞增殖分化的重要信号通路，为阐明椎间盘中低氧环境和Notch信号通路参与调节髓核细胞增殖和细胞外基质合成的可能机制，我们拟通过实验明确以下几个问题：①不同氧浓度培养对大鼠髓核细胞细胞增殖、细胞周期、表型表达等的影响，Notch信号抑制剂对髓核细胞增殖的影响；②不同浓度低氧模拟类似物去铁胺干预髓核细胞对髓核细胞增殖、细胞周期、表型表达等的影响；③比较不同氧浓度和去铁胺干预条件下大鼠髓核细胞Notch通路相关靶基因和HIF-α的表达情况，初步阐明氧浓度和去铁胺促进髓核细胞增殖的可能机制。研究内容 ①取4只3周龄SD大鼠（体重200至220克左右），2.5%戊巴比妥麻醉，脊柱区皮肤备皮，无菌条件下取出腰段脊柱，分离获得Uk喱状髓核组织，，0.2%II型胶原酶消化，将获得的髓核细胞进行原代培养。实验中采用第三代髓核细胞，进行相关染色，免疫细胞化学和半定量PCR方法鉴定髓核细胞表型。将髓核细胞分别置于常氧（21%O2）和低氧（1%O2）条件下培养8至24小时，通过CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖情况，通过流式细胞仪检测细胞周期变化情况；运用Notch信号通路抑制剂干预髓核细胞，CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期变化，通过Real-time PCR检测不同氧浓度干预下髓核细胞表型表达变化。 ②运用不同浓度去铁胺（25umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L）干预髓核细胞，通过CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期变化，通过Real-time PCR检测适当浓度去铁胺对髓核细胞表型表达的影响。 ③将髓核细胞分别置于常氧、低氧及去铁胺干预条件下培养8至48小时，通过Real-time PCR、Western-blot检测不同培养条件下Notch信号通路相关分子及HIF-α的表达情况，初步探讨氧浓度及去铁胺影响髓核细胞增殖的可能机制。结果 ①CCK-8结果显示：与常氧培养相比，髓核细胞在低氧培养时所测OD值明显升高；无论在常氧或低氧培养条件下，加入Notch抑制剂干预后所测OD值明显降低；流式细胞仪结果显示：与常氧培养相比，髓核细胞在低氧培养时处于S期细胞所占百分率明显升高，加入Notch抑制剂干预后处于S期细胞所占百分率明显降低；低氧干预后，髓核细胞COL2A1、Aggrecan、Sox-9、COL1A1mRNA表达水平都有不同程度升高。 ②CCK-8结果显示：25umol/L、50umol/L去铁胺干预髓核细胞时，OD值明显升高，200umol/L去铁胺干预时，OD值明显下降，而100umol/L去铁胺干预时，OD值与对照组相比无明显差异；流式细胞仪结果显示：50umol/L去铁胺干预时，处于S期细胞所占百分比都有增加，与对照组相比差异具有统计学意义；50umol/L DFO干预髓核细胞后COL2A1、Aggrecan mRNA表达升高，Sox-9mRNA表达水平下降，COL1A1mRNA无明显变化。 ③髓核细胞在低氧培养8~24小时后，Notch靶基因Hes1、Hes5、Hes7mRNA都有不同程度上调，Hey1、Hey2mRNA表达水平下调；Hes1、Hes7蛋白在低氧干预24~48小时后表达上升，而Hes5表达水平无明显变化；低氧干预24~48小时后HIF-1αmRNA和蛋白质水平都有明显上调，HIF-2α表达无明显变化。50umol/L去铁胺干预后,髓核细胞Notch信号通路靶基因Hes1、Hes7、Hey1mRNA表达都有不同程度下降，Hes7蛋白表达水平下降，Hes5表达水平无明显变化；去铁胺干预后HIF-1α和HIF-2α表达水平都有不同程度升高。结论 ①体外低氧微环境可以促进髓核细胞增殖和细胞外基质合成； ②体外低氧微环境可以通过上调Notch信号靶基因的表达水平来促进髓核细胞增殖，Notch信号相关靶基因可以作为研究靶点，用于体外调控髓核细胞增殖分化的过程； ③体外适当浓度去铁胺可以促进髓核细胞增殖和细胞外基质合成，去铁胺可能通过上调HIF-1α/HIF-2α的方式参与调节髓核细胞增殖的过程，去铁胺可能作为一种治疗药物用于延缓椎间盘退变的过程。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R681.53

【参考文献】