脾虚大鼠肠黏膜屏障功能变化及四君子汤对其影响的实验研究

发布时间：2019-06-03 09:14

【摘要】：一直以来，人们对胃肠道的研究多集中在营养物质消化吸收方面，随着基础及临床研究的不断深入，胃肠道黏膜屏障功能越来越受到重视。肠黏膜屏障功能的稳定直接影响消化系统疾病的发生、发展和转归，并且肠黏膜屏障在抵御内外致病因素侵入机体方面显示了重要作用。肠黏膜屏障由上皮细胞紧密连接、分泌的黏液、肠道常驻菌群及肠道分泌型抗体、相关性淋巴样组织等构成。其中黏蛋白(Mucin, MUC)是一种高分子质量的糖蛋白, MUC2由结肠、小肠等的杯状细胞分泌，也被叫做肠黏蛋白，是正常肠道黏液的主要组成部分，在一定状态下黏性很高。MUC3是跨膜黏蛋白，主要在小肠、结肠绒毛上皮细胞中表达, MUC5AC主要在胃黏膜上皮细胞表达，而在一些病理情况下如炎性肠病、肿瘤等，也可表达于肠黏膜。黏蛋白可以润滑肠道，在肠黏膜形成保护性屏障，黏附致病性因子，在细胞间信号传导及抗原呈递过程中也发挥一定作用，保护肠上皮。肠三叶因子(TFF3)在肠道中广泛存在，可与黏蛋白共同组成网状结构，保护黏膜，抵御机械及化学损伤，也可以驱动上皮细胞迁移，修复损伤，保持肠黏膜完整。黏蛋白和三叶因子在肠道黏膜屏障中都发挥了积极作用。肠道内的常驻菌群为肠道形成了一道生物屏障，可以防止致病菌侵袭，使得肠道内微生态环境平衡稳定。肠黏膜T淋巴细胞及分泌型抗体如sIgA，可以通过免疫反应抑制、排除致病因子，中和毒素，通过其免疫屏障作用保护黏膜功能。肠黏膜各屏障之间相互协调，相互依赖，形成统一的屏障体系保护机体，抵御各种致病因素。中医学理论中脾为后天之本，脾自身具有重要的生理作用，又能为其他脏腑及营卫运行提供物质基础，保卫机体健康。脾的功能直接影响机体防御疾病的能力，因此有脾主为卫，脾虚则百病内生之说。肠黏膜屏障作为胃肠的防御机制，与中医“脾为之卫”具有相同的病理生理基础。本研究在“脾为之卫”理论基础上，从不同角度观察脾虚大鼠肠黏膜屏障功能的变化，及益气健脾中药中经典方剂四君子汤对其作用，进而探讨脾虚对肠道黏膜屏障功能的影响及中药的防治作用。第一部分脾虚大鼠肠黏膜变化及四君子汤对其影响的实验研究目的：分析脾虚与肠黏膜屏障功能改变之间的相关性，观察脾虚大鼠肠黏膜病理学变化情况及益气健脾中药对其影响。材料与方法：SPF级2-3月龄SD大鼠共48只，随机分成4组，分别为正常对照组、脾虚模型组、自然复健组和四君子汤组，在造模期间采用标准固体饲料喂饲各组大鼠,对各脾虚模型组进行复合因素造模，同时，等量生理盐水灌饲正常对照组大鼠，造模时间共计7周。采用劳倦过度、饮食不节与药物损伤相结合的方法建立脾虚模型，在模型组造模成功的基础上施加中药治疗，符合纳入标准的动物取材备检。腹主动脉取血后处死大鼠，取肠黏膜组织经常规脱水、包埋、染色，制作切片。懫用光镜观察各组大鼠肠黏膜病理学改变。结果：400x光镜下观察，正常对照组大鼠肠黏膜结构完整，纹理清晰,无炎性反应及损伤；脾虚模型组肠黏膜缺损，固有层、黏膜下层血管扩张充血、出血，黏膜下层为浆细胞浸润。自然复健组肠黏膜缺损，炎细胞浸润，血管扩张充血；黏膜下层水肿，血管扩张充血，炎细胞浸润。四君子汤组大鼠肠黏膜厚度基本恢复正常,腺体排列较整齐。结论：采用劳倦过度、饮食不节与药物损伤相结合的方法可诱导脾虚大鼠模型，脾虚状态下，肠黏膜结构完整性破坏，而益气健脾中药汤剂四君子汤能够修复肠黏膜基本结构。第二部分脾虚大鼠肠黏膜黏蛋白（MUC2，MUC3，MUC5AC）及三叶因子(TFF3)变化及四君子汤对其影响的实验研究目的：观察脾虚大鼠肠黏膜黏蛋白、三叶肽因子的变化，并观察中药方剂四君子汤对其影响，从肠黏膜机械、化学屏障功能变化等角度，，探讨脾虚证“脾为之卫”作用的发生机制。材料与方法：同第一部分处理大鼠，取回肠及结肠黏膜组织分别采用Western-Blot法及免疫组化方法检测正常对照组及脾虚模型各组大鼠肠黏膜黏蛋白(MUC2，MUC3，MUC5AC)及三叶肽因子蛋白表达的变化， RT-PCR法检测大鼠肠黏膜黏蛋白(MUC2，MUC3，MUC5AC)mRNA表达变化。结果：与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠组织中MUC2，MUC3蛋白表达均有降低(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜组织中MUC2，MUC3蛋白表达较脾虚模型组及自然复健组有所上调，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠黏膜组织中MUC2mRNA表达降低(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜组织中MUC2mRNA表达较脾虚模型组及自然复健组有所上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠组织中MUC5AC蛋白及mRNA均有表达，经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜组织中MUC5AC蛋白及mRNA表达较脾虚模型组及自然复健组有所下降，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠黏膜组织中TFF3蛋白表达均有降低(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜组织中TFF3蛋白表达较脾虚模型组及自然复健组有所上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠黏膜组织中TFF3mRNA表达均有降低(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜组织中TFF3mRNA表达较脾虚模型组及自然复健组有所上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论： 1.脾虚状态下，肠黏膜分泌黏蛋白(MUC2，MUC3)减少，经益气健脾中药汤剂四君子汤治疗后，黏蛋白分泌增加，提示四君子汤可能修复大鼠肠黏膜机械、化学屏障。 2.脾虚可引起TFF3分泌减少，经四君子汤治疗后，TFF3分泌增加，提示四君子汤对大鼠肠黏膜屏障的修复作用。第三部分脾虚大鼠血清内毒素变化及四君子汤对其影响的实验研究目的：观察大鼠血清内毒素的变化及益气健脾中药对其影响。从内毒素与肠黏膜生物屏障功能变化角度，探讨脾虚证病理状态对机体生物屏障影响。材料与方法：将大鼠麻醉后，采集腹主动脉全血2ml，采用酶联免疫吸附（ELISA）双抗体夹心法对第一部分中各组大鼠血清中内毒素含量进行检测，于450nm处检测各孔吸光度（OD）值，拟合标准曲线及方程，计算结果，进行统计分析。结果：与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组血清中内毒素含量均有升高(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组血清内毒素含量较脾虚模型组及自然复健组有所下降，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。结论：脾虚时肠黏膜生物屏障受到损伤，导致肠道细菌和内毒素易位，四君子汤能改善内毒素血症，修复肠黏膜生物屏障。第四部分脾虚大鼠肠黏膜分泌型免疫球蛋白A（sIgA）,T淋巴细胞（CD3）变化及四君子汤对其影响的实验研究目的：观察大鼠肠黏膜CD3阳性T淋巴细胞及sIgA的变化及中药对其影响，从肠黏膜免疫屏障功能变化角度出发，研究脾虚状态下肠黏膜免疫屏障变化，探讨脾虚对机体免疫功能的影响。材料与方法：刮取大鼠回肠黏膜组织，收集于试管中,加入PBS溶解，离心后采用ELISA法检测各组大鼠肠黏膜sIgA变化；用流式细胞仪检测各组大鼠肠黏膜中CD3阳性T淋巴细胞百分比的变化。结果：与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠黏膜sIgA含量均有下降(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜sIgA含量较脾虚模型组及自然复健组有所增加，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。与正常对照组比较，脾虚模型组、自然复健组及四君子汤组肠黏膜中CD3阳性T细胞百分比均有下降(P＜0.01），经四君子汤治疗性给药，四君子汤组肠黏膜中CD3阳性T细胞百分比较脾虚模型组及自然复健组有所增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：脾虚时sIgA分泌及CD3表达减少，局部黏膜免疫功能下降，四君子汤可有效提高大鼠黏膜免疫功能，减少肠黏膜屏障损伤。
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【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R285.5

【引证文献】