补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞成骨分化和凋亡的作用研究
发布时间：2019-07-11 14:44
【摘要】：目的:探讨补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化和凋亡的影响。材料与方法:Wistar大鼠,18只,雌雄各半,六周龄,体重200±20g,随机分为三组:空白对照组,补肾健脾活血方组,二甲双胍组,每组6只。根据等临床剂量换算进行灌胃给药:空白对照组灌服蒸馏水,补肾健脾活血方组灌服补肾健脾活血方混悬液,二甲双胍组灌服盐酸二甲双胍混悬液,每日灌胃1次,在第7d给药2h后,腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,静置2h后,离心(2500rpm,4℃,20min),收集血清,同组混匀,56℃水浴灭活30min,经滤膜过滤后分装,-86℃保存。实验分为空白对照组、高糖组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、二甲双胍组。采用CCK-8法,筛选葡萄糖对MC3T3-E1细胞干预的最适剂量和检测各组成骨细胞增殖率;对硝基苯磷酸盐法(PNPP)检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性;ELISA法检测骨钙素(OC)含量;流式细胞术Anexin-V/PI双染法检测成骨细胞凋亡率;蛋白质免疫印记技术(Western-blot)检测成骨分化相关蛋白BMP2和Runx2的表达和凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测BMP2、Runx2、Bax和Bcl-2 m RNA的表达。结果:1.不同浓度葡萄糖对MC3T3-E1细胞增殖抑制率的影响与空白对照组比较,细胞培养24h和48h,葡萄糖浓度为25 mmol/L和33 mmol/L组细胞的抑制率均显著升高,有统计学意义(p0.01),细胞培养72小时,葡萄糖浓度为16.7mmol/L、25 mmol/L和33 mmol/L组细胞的抑制率均升高(p0.01或p0.05)。2.补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞增殖能力的影响与空白对照组比较,细胞培养24h、48h和72h,高糖组细胞增殖能力均显著降低(p0.01);与高糖组比较,细胞培养24h、48h,中药低剂量组细胞增殖能力升高(p0.05),细胞培养24h、48h和72h,中药中、高剂量组和二甲双胍组细胞增殖能力显著升高(p0.01);与二甲双胍组比较,细胞培养24h、48h和72h,中药低、高剂量组细胞增殖能力显著降低(p0.01);与中药低剂量组比较,细胞培养24h、48h和72h,中药中剂量组细胞增殖能力显著升高(p0.01)。3.补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞成骨分化的影响3.1补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞ALP活性的影响与空白对照组比较,细胞培养1d、3d、5d、7d,高糖组细胞ALP活性均显著降低(p0.01);与高糖组比较,细胞培养3d、5d、7d,中药低剂量组细胞ALP活性升高(p0.05或p0.01),细胞培养1d、3d、5d、7d,中药中、高剂量组和二甲双胍组细胞ALP活性显著升高(p0.05或p0.01);与二甲双胍组比较,细胞培养1d、3d、5d、7d,中药低剂量组细胞ALP活性降低(p0.05或p0.01),其他各组无显著性差异(p0.05);与中药低剂量组比较,细胞培养3d、5d、7d,中药中剂量组ALP活性显著升高(p0.01)。3.2补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞上清液OCN的影响与空白对照组比较,细胞培养3d、5d、7d、14d,高糖组细胞骨钙素的分泌均显著降低(p0.01);与高糖组比较,细胞培养3d、5d、7d、14d,中药中、高剂量组和二甲双胍组细胞骨钙素分泌能力均显著升高(p0.01);与二甲双胍组比较,细胞培养3d、5d、7d、14d,中药低剂量组细胞骨钙素分泌能力显著降低(p0.01),细胞培养5d、7d、14d,中药高剂量组骨钙素分泌能力降低(p0.05或p0.01);与中药低剂量组,细胞培养3d、5d、7d、14d,中药中、高剂量组骨钙素分泌能力显著增高(p0.01)。3.3补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞BMP2、Runx2蛋白表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组的BMP2、Runx2蛋白表达均显著减少(p0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组和二甲双胍组的BMP2、Runx2蛋白表达量均有所增加(p0.05或p0.01);与二甲双胍组比较,中药低、中、高剂量组的BMP2蛋白表达均显著减少(p0.01),中药低、中剂量组的Runx2蛋白表达减少(p0.05);与中药低剂量比较,中药中、高剂量组的BMP2、Runx2蛋白表达均无统计学意义(p0.05)。3.4补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞BMP2 m RNA、Runx2 m RNA表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组的BMP2、Runx2基因表达均显著减少(p0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组对BMP2、Runx2基因表达均有一定程度的增加(p0.05或p0.01);与二甲双胍组比较,中药低、中、高剂量组对BMP2基因表达均显著减少(p0.01),中药低、中剂量组的Runx2基因表达均减少(p0.05或p0.01);与中药低剂量组比较,中药高剂量组对Runx2基因表达显著增加(p0.01)。4.补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞凋亡的影响4.1流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡与空白对照组比较,高糖组细胞凋亡率显著增高(p0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组的细胞凋亡率均显著降低(p0.01);与二甲双胍组比较,中药低、高剂量组细胞凋亡率增高(p0.05或p0.01);与中药低剂量组比较,中药中剂量组细胞早期凋亡率显著减少(p0.01)。4.2补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响与空白对照组比较,高糖组Bcl-2/Bax的比值显著减少(p0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组Bcl-2/Bax的比值增加(p0.05或p0.01);与二甲双胍组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax的比值显著增加(p0.01),中药低、中剂量组均显著减少(p0.01);与中药低剂量组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax比值显著增加(p0.01)。4.3补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞Bax、Bcl-2 m RNA表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组Bcl-2/Bax的比值显著减少(p0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组Bcl-2/Bax的比值显著增加(p0.01);与二甲双胍组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax的比值增加(p0.05),中药低、中剂量组均显著减少(p0.01);与中药低剂量组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax比值显著增加(p0.01)。结论:1.补肾健脾活血方能促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖与分化。2.补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞凋亡有抑制作用。
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图片说明： 葡萄糖对成骨细胞增殖抑制率的影响表 1-2 和图 1-2，从表 1-2 和图 1-2 可以看出，与空白对照组比较，细胞，葡萄糖浓度为 25 mmol/L 和 33 mmol/L 组细胞的抑制率均显著升高，＜0.01)，细胞培养 72h，葡萄糖浓度为 16.7mmol/L、25 mmol/L 和 33 m制率均升高(p＜0.01 或 p＜0.05)。表 1-2 各组不同时间段 MC3T3-E1 细胞增殖抑制率的影响（x s）组别 24h 48h 72h空白对照组 0.532±0.038 0.865±0.046 1.165±0.04616.7mmol/L 0.491±0.022 0.825±0.018 1.05±0.035*25mmol/L 0.34±0.0265**0.640±0.026**0.84±0.026**33mmol/L 0.206±0.015**0.506±0.015**0.706±0.015**空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01
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图片说明： 补肾健脾活血方对高糖环境下 MC3T3-E1 细胞成骨分化及凋亡的作用剂量组和二甲双胍组细胞增殖能力显著升高(p＜0.01)；与二甲双胍组比较h、48h 和 72h，中药低、高剂量组细胞增殖能力显著降低(p＜0.01)；与中较，细胞培养 24h、48h 和 72h，中药中剂量组细胞增殖能力显著升高(p 1-3 补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞增殖能力的影响（x s）组别 24h 48h 72h空白对照组 0.597±0.038 0.696±0.041 0.799±0.06高糖组 0.418±0.017**△△0.518±0.019**△△0.7±0.025*△△中药低剂量组 0.457±0.016★△△0.556±0.013★△△0.659±0.021★△△中药中剂量组 0.559±0.021★★##0.666±0.027★★##0.768±0.059★★##中药高剂量组 0.483±0.015★★△△0.582±0.011★★△△0.684±0.035★★△△二甲双胍组 0.561±0.016★★0.661±0.031★★0.779±0.061★★，与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与高糖组比较，★p<0.05，★★p<0.01；，，△△p<0.01；与中药低剂量组比较，#p<0.05，##p<0.01
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
文内图片：
图片说明： 葡萄糖对成骨细胞增殖抑制率的影响表 1-2 和图 1-2，从表 1-2 和图 1-2 可以看出，与空白对照组比较，细胞，葡萄糖浓度为 25 mmol/L 和 33 mmol/L 组细胞的抑制率均显著升高，＜0.01)，细胞培养 72h，葡萄糖浓度为 16.7mmol/L、25 mmol/L 和 33 m制率均升高(p＜0.01 或 p＜0.05)。表 1-2 各组不同时间段 MC3T3-E1 细胞增殖抑制率的影响（x s）组别 24h 48h 72h空白对照组 0.532±0.038 0.865±0.046 1.165±0.04616.7mmol/L 0.491±0.022 0.825±0.018 1.05±0.035*25mmol/L 0.34±0.0265**0.640±0.026**0.84±0.026**33mmol/L 0.206±0.015**0.506±0.015**0.706±0.015**空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01
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图片说明： 补肾健脾活血方对高糖环境下 MC3T3-E1 细胞成骨分化及凋亡的作用剂量组和二甲双胍组细胞增殖能力显著升高(p＜0.01)；与二甲双胍组比较h、48h 和 72h，中药低、高剂量组细胞增殖能力显著降低(p＜0.01)；与中较，细胞培养 24h、48h 和 72h，中药中剂量组细胞增殖能力显著升高(p 1-3 补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞增殖能力的影响（x s）组别 24h 48h 72h空白对照组 0.597±0.038 0.696±0.041 0.799±0.06高糖组 0.418±0.017**△△0.518±0.019**△△0.7±0.025*△△中药低剂量组 0.457±0.016★△△0.556±0.013★△△0.659±0.021★△△中药中剂量组 0.559±0.021★★##0.666±0.027★★##0.768±0.059★★##中药高剂量组 0.483±0.015★★△△0.582±0.011★★△△0.684±0.035★★△△二甲双胍组 0.561±0.016★★0.661±0.031★★0.779±0.061★★，与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与高糖组比较，★p<0.05，★★p<0.01；，，△△p<0.01；与中药低剂量组比较，#p<0.05，##p<0.01
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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1 李颖;黄宏兴;姜志强;;补肾健脾中药复方干预成骨细胞内细胞凋亡蛋白的机制研究[J];中国骨质疏松杂志;2016年11期
2 陈水昌;李颖;卢国森;;补肾健脾中药复方调节内质网蛋白GADD34、ERO1、IRE-1干预成骨细胞凋亡的机制研究[J];山西中医学院学报;2016年05期
3 王芳;高英;李卫民;陈s
本文编号：2513239
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