低能量体外冲击波治疗联合骨髓间充质干细胞移植改善糖尿病大鼠勃起功能

发布时间：2019-11-14 20:57

【摘要】：研究背景勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)对患者本人的生活质量,幸福感以及患者与配偶的关系有着非常不利的影响。40岁以上的男性,大约有20%患有不同程度的ED。全球糖尿病的发病率逐年增加是导致ED发病率上升的一个重要因素。糖尿病性ED病理机制复杂,并且难以治愈,一线治疗方案5型磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesterase 5 inhibitors,PDE5i)对糖尿病ED患者治疗效果有限。修复阴茎海绵体组织受损的细胞是重建糖尿病患者勃起功能所必须要面对的问题。干细胞移植和低能量体外冲击波治疗(low energy shock wave therapy, LESWT)是糖尿病性ED非常有潜力的治疗方法。研究发现干细胞移植可以恢复糖尿病大鼠海绵体组织中血管内皮细胞、平滑肌细胞、一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase, NOS)阳性神经纤维的数量,提高平滑肌纤维/胶原比值,恢复血管内皮细胞功能,进而改善勃起功能。但研究也发现无论采用何种干细胞：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)或脂肪源性干细胞(adipose tissue derived stem cell, ADSC),无论针对何种勃起功能障碍动物模型：糖尿病或海绵体神经损伤(cavernous nerve injury, CNI),移植后海绵体组织中的干细胞均迅速离开海绵体,4周后海绵体组织中可检测到的干细胞数量非常稀少。另外,大量研究从不同角度反应出干细胞移植的治疗效果与碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)水凝胶、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly-Lactic-Co-Glycolic, PLGA)膜,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因修饰或LESWT相比并不具有显著优势。采用脂肪基质、PLGA膜、水凝胶、自体静脉瓣、藻酸盐凝胶海绵等细胞辅助支架有利于促使更多的移植干细胞定植于受损的阴茎海绵体神经和盆大神经节(major pelvic ganglion, MPG)周围,提高移植干细胞的定植数量,提高移植干细胞对受损海绵体神经的修复作用,并提高治疗效果。提示提高移植干细胞在靶器官中的存活数量,是提高干细胞移植治疗效果的所必须面对的问题。然而细胞辅助支架无法在海绵体组织内使用,并不适用于糖尿病性ED的动物模型LESWT的作用效果与干细胞移植类似。LESWT也可以恢复糖尿病大鼠海绵体组织中血管内皮细胞、平滑肌细胞、NOS阳性神经纤维的数量,提高平滑肌纤维/胶原比值,恢复血管内皮细胞功能,改善勃起功能。LESWT的作用机制可能与动员和活化机体内源性干细胞有关,一方面LESWT可以募集内源性干细胞到达糖尿病大鼠的海绵体组织；另一方面海绵体组织含有包括白膜下阴茎祖细胞、窦周间隙阴茎祖细胞和海绵体平滑肌肌源性干细胞等多种内源性干细胞,而LESWT对内源性干细胞的活化作用,可能参与了LESWT对糖尿病大鼠勃起功能的修复过程。结合LESWT在其它动物模型的相关研究结果,我们推测LESWT可能具有抑制移植干细胞离开海绵体组织,提高移植干细胞在阴茎海绵体的存活数量,并提高干细胞移植改善糖尿病大鼠勃起功能的作用。移植后海绵体内可检测到的标记干细胞数量稀少与移植干细胞入血移行有关。追踪阴茎海绵体神经损伤大鼠,经海绵体注射的间充质干细胞发现,干细胞在移植后1周内既迅速离开海绵体进入骨髓,提示干细胞在移植后离开海绵体组织是导致移植后海绵体组织中难以发现标记干细胞的主要原因。干细胞在体内移行,受基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)、VEGF等细胞因子的调控。已有研究证实,LESWT可以通过提高肢体缺血组织中的SDF-1表达水平,募集内源性和外源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)到达缺血部位。并且在CNI动物模型中已经观察到移植干细胞逆SDF-1浓度梯度,向受损的海绵体神经和MPG聚集的现象。然而,糖尿病机体SDF-1介导的骨髓源性干细胞动员失败,循环血干细胞数量减少导致组织修复功能损害。糖尿病ED的患者外周血EPC数量减少。对于糖尿病大鼠,通过能否通过LESWT抑制移植干细胞离开阴茎海绵体组织及其可能的机制,目前未见研究报道,还有待实验进一步证实。干细胞移植后阴茎海绵体内存活的干细胞数量稀少,可能还与靶器官组织相对恶劣的生存环境有关。研究表明糖尿病可以损害海绵体组织内的新血管形成,包括导致外周血EPC动员障碍、抑制VEGF促新血管形成信号通路和降低阴茎海绵体组织内的CD31+细胞数量。外周血EPC可进入到阴茎海绵体组织,对受损的血管内皮细胞进行修复；VEGF可以动员内源性EPC,促进海绵体组织内的新血管形成；而CD31+细胞被认为是BMSC构成niche的重要组成部分。LESWT可通过提高外周血EPC的数量,募集更多的内源性EPC到达海绵体组织；活化阴茎海绵体组织的内源性干细胞,促进内源性干细胞增殖；提高阴茎海绵体组织CD31+细胞的数量和VEGF表达水平,促进新血管形成,辅助移植的BMSC在海绵体组织中建立niche,为移植的BMSC提高营养支持,从而提高移植BMSC在海绵体组织中的存活数量。对于糖尿病大鼠,通过能否通过LESWT来提高移植干细胞在阴茎海绵体内的存活数量及其可能的机制,目前也未见研究报道,需要实验进一步证实。LEWST和BMSC移植均可以恢复糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中血管内皮细胞、平滑肌细胞、NOS阳性神经纤维的数量,提高平滑肌纤维／胶原比值,恢复血管内皮细胞功能,改善勃起功能。移植的BMSC可通过转化或旁分泌机制发挥修复作用；LESWT可通过动员、募集内源性干细胞达到阴茎海绵体组织,活化阴茎海绵体组织内干细胞,促进阴茎海绵体内新血管形成等机制发挥修复作用。对于海绵体神经损伤大鼠,ADSC移植可以促进盆大神经节处受损的阴茎海绵体神经修复,LESWT则有助于阴茎海绵体内的血管修复,ADSC移植联合LESWT可以取得较单独进行ADSC移植或LESWT更加理想的治疗效果。与海绵体神经损伤ED动物模型需要将盆大神经节和海绵体组织均作为靶器官不同,糖尿病ED动物模型仅需将海绵体组织作为靶器官。若LESWT可提高移植干细胞在靶器官的存活数量,对于糖尿病大鼠LESWT联合BMSC移植能否更加有效地改善勃起功能,目前也未见研究报道,需要实验进一步证实。综上所述,干细胞移植和LESWT均可以改善糖尿病大鼠的勃起功能。移植干细胞在海绵体组织中存活数量稀少,严重影响了干细胞移植改善勃起功能的治疗效果。移植干细胞在海绵体组织中存活数量稀少与干细胞离开海绵体组织经血液循环进入骨髓及糖尿病导致海绵体组织微血管损害有关。在本研究中我们推测：LESWT可提高移植干细胞在海绵体组织中的存活数量更加有效地改善糖尿病大鼠的勃起功能,其机制可能与提高阴茎海绵体组织SDF-1的表达水平和促进海绵体组织新血管形成有关。但因为糖尿病状态下SDF-1介导的内源性干细胞动员障碍导致外周血EPC数量减少,对于糖尿病大鼠动物模型,能否对LESWT产生反应,提高移植干细胞在阴茎海绵体内的存活数量并提高治疗效果还有待实验验证。实验目的1.评估LESWT对糖尿病大鼠外周EPC数量的影响；2.评估LESWT对移植BMSC在糖尿病大鼠海绵体内存活数量的影响；3.评估LESWT联合BMSC移植改善糖尿病大鼠勃起功能的作用效果和相关机制。实验方法1、LESWT糖尿病大鼠外周血EPC数量的影响24只大鼠采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠动物模型后,随机分为2组,每组12只。LESWT处理大鼠海绵体组织,共3周6次。在冲击波治疗前、冲击波治疗结束后1天,采用流式细胞术测定大鼠外周血CD31/CD34双阳性EPC的百分数,并比较两组外周血CD31/CD34双阳性EPC数量的差异。2、LESWT对移植BMSC在糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中存活数量的影响采用贴壁法分离、培养SD大鼠BMSC,流式细胞术鉴定BMSC表面标记CD29、CD34、CD44、CD45和CD90,并采用细胞荧光标记液DiO标记BMSC。18只SD大鼠采用STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠动物模型后,随机分为2组,每组9只。冲击波治疗组接受3周6次的LESWT后,两组同时经海绵体注射1X106个DiO标记的BMSC。在干细胞移植后1天、3天和28天,分别于麻醉后取3只大鼠海绵体组织,荧光显微镜下人工计数法检测两组海绵体组织中DiO标记BMSC的数量。3、LESWT联合BMSC移植对糖尿病大鼠勃起功能的影响30只SD大鼠采用STZ建立糖尿病大鼠动物模型后,随机分为4组。其中糖尿病组6只,LESWT组6只,BMSC移植组9只,LESWT+BMSC移植组9只,另取6只健康SD大鼠做为正常对照组。LESWT和BMSC移植方案同前。干细胞移植4周后,麻醉后检测各组海绵体内压/平均动脉压(Intracavernosal pressure/mean arterial pressure, ICP/MAP)以评估大鼠的阴茎勃起功能,然后切取海绵体组织通过实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测海绵体组织SDF-1和VEGF表达水平,通过免疫组化评估海绵体组织CD31、内皮源性一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达水平,以及通过Masson Trichrome染色评估海绵体组织中平滑肌纤维／胶原比值。统计学处理观测结果采用均数±标准误来表示。组间比较采用One-way ANOVA,两组间比较用非配对t检验,统计软件采用SPSS 17.0。结果1、LESWT对糖尿病大鼠外周血EPC数量的影响糖尿病组与LESWT组在冲击波处理前,两组间外周血CD31/CD34双阳性EPC百分数无统计学差异(p=0.515)；在为期三周6次的LESWT处理后24小时,LESWT组的CD31/CD34双阳性EPC百分数均显著高于糖尿病组(p0.001)。2、LESWT对移植BMSC在糖尿病大鼠阴茎海绵体内存活数量的影响结果发现分离、培养的BMSC高表达CD29,CD44,CD90,低表达CD34和CD45,并具有较高的纯度。我们采用放大200倍荧光倒置显微镜,观测每个视野内DiO标记BMSC数量。在BMSC移植后1天,BMSC移植组和LESWT+BMSC移植组两组阴茎海绵体内可检测到干细胞数量基本一致(p=0.143)。BMSC移植3天后,BMSC移植组阴茎海绵体内DiO标记的BMSC迅速减少,而LESWT+BMSC移植组阴茎海绵体内仍有大量的DiO标记的BMSC驻留(p0.001)。BMSC移植4周后,在BMSC移植组的阴茎海绵体中难以发现标记的BMSC,而在LESWT+BMSC移植组阴茎海绵体仍有较多的DiO标记的BMSC存活(p0.001)。3、LESWT联合BMSC移植改善糖尿病大鼠勃起功能的治疗效果LESWT结束和BMSC移植后四周,我们通过测定ICP/MAP评估糖尿病大鼠的勃起功能,结果糖尿病组ICP/MAP要显著低于正常组(P0.001),LESWT和BMSC移植均可以有效改善糖尿病大鼠的勃起功能(p=0.002,p=0.017),但LESWT+BMSC移植组的治疗效果优于LESWT组和BMSC移植组(p0.001,p0.001)。RT-PCR检测：与糖尿病组比较,LESWT、BMSC移植及LESWT+BMSC移植均可以提高海绵体组织中SDF-1(p=0.029；p=0.005,p0.001)和VEGF(p=0.021；p=0.004,p0.001)的表达水平,但LESWT+BMSC移植组升高得最为显著,与LESWT组和BMSC移植组相比具有统计学差异(SDF-1：p0.001,p0.001；VEGF:p=0.012,p=0.042)。免疫组化：与正常组比较,糖尿病组阴茎海绵体组织中CD31、eNOS、α-SMA和平滑肌纤维／胶原比值均明显下降(p0.001,p0.001,p0.001,p0.001)。与糖尿病组比较,LESWT和BMSC移植均可以有效提高上述指标的表达水平(LESWT组：p=0.002,p=0.031,p0.001,p=0.002；BMSC移植组：p0.001,p=0.013,p=0.014,p=0.002)。LESWT+BMSC移植较单独LESWT治疗可以更显著地提高CD31和eNOS表达水平(p=0.002,p=0.007),较BMSC移植更有效地提高α-SMA表达水平(p=0.022)。LESWT+BMSC移植对糖尿病大鼠平滑肌纤维／胶原比值恢复较LESWT或BMSC移植均更为显著(p=0.005,p=0.005)。结论LESWT可以通过提高阴茎海绵体组织中SDF-1和VEGF的表达水平,LESWT可以提高外周血中EPC的数量；使更多的移植BMSC驻留于阴茎海绵体；提高移植BMSC在阴茎海绵体组织中的存活数量,其机制可能与提高阴茎海绵体组织中SDF-1表达水平和促进阴茎海绵体组织新血管形成有关；LESWT和BMSC移植均可以提高糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中血管内皮细胞的数量、eNOS和α-SMA的表达水平、平滑肌纤维／胶原比值,并改善勃起功能；LESWT联合BMSC移植,较单独采用LESWT或BMSC移植,可以更加有效地改善糖尿病大鼠勃起功能。
【图文】：

糖尿病,外周血

逦ｅＦＩｕｏｒ邋６６０－Ａ逡逑图２－３ｂ：邋ＬＥＳＷＴ后２４小时，糖尿病组逦图２－３ｃ：ＬＥＳＷＴ后２４小时，ＬＥＳＷＴ组逡逑外周血ＥＰＣ含量逦外周血目ＰＣ含量逡逑Ｆｉｒｇｕｒｅ２－３ｂ邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ－ＬＥＳＷＴ，逦Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３ｃ邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ－ＬＥＳＷＴ，，逡逑ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ邋ＥＰＣ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ邋ＤＭ逦ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ邋ＥＰＣ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ邋ＬＥＳＷＴ逡逑ｇｒｏｕｐ逦ｇｒｏｕｐ逡逑图２－３；流式细胞术结果提示糖尿病组及糖尿病ＬＥＳＷＴ处理组在ＬＥＳＷＴ处理前，外逡逑周血ＣＤ３１、ＣＤ３４数量无明显差异；经过为期３周的ＬＥＳＷＴ处理后，ＬＥＳＷＴ组外周血逡逑ＥＰＣ含量显著升高，并具有统计学意义（ｐ＜０．００１）（图３ａ）。其中ＰＥ阳性细胞代表ＣＤ３４＋逡逑细胞，ｅＦｌｏｕｒ６６０－Ａ阳性细胞代表ＣＤ３１＋细胞，Ｑ２区为ＣＤ３Ｉ／ＣＤ３４双阳性细胞，反应相逡逑同测量时间点两组外周血中ＥＰＣ的百分率（图３ｂ为糖尿病组；图３ｃ为糖尿病ＬＥＳＷＴ组）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３：邋Ｆｌｏｗ邋ｃｙ化ｍｅｔｒｉｃ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｅｒｉｐｈｅｎｌ邋ｂｌｏｏｄ邋ｒｅｖｅａｌｅｄ：邋ｂｅ估ｒｅ邋ＬＥＳＷＴ

倒置显微镜,聚集生长

刚开始体外分离获得的骨髓间充质干细胞为圆形，悬浮在培养液中。过夜逡逑后细胞逐渐开始贴壁。贴壁细胞逐渐成簇状聚集生长，逐渐融合呈游祸状排列，逡逑细胞呈纺锥形或《角形，并向四周伸出伪足样突起。（图３－１）。逡逑＾ｎｉ逡逑图３－ｌａ：倒置显微镜Ｘ４０逦图３－化：倒置显微镜ＸｌＯＯ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－ｌａ．邋Ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋Ｘ４０逦Ｆｉｇｕｒｅ邋３－Ｉｂ．邋Ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ＸＩ００逡逑图３－ｈ如图所示：图３－ｌａ：第三代ＢＭＳＣ（倒置盈微镜，Ｘ４０），成簇状聚集生长，逐渐融合逡逑呈舰满状排列：图３－化：第兰代ＢＭＳＣ邋（倒置显微馈Ｘ１００）细胞呈纺健形或多角形，并向逡逑四周伸出伪足样突起。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１：邋Ｐａｓｓａｇｅ邋化ｒｅｅ邋ＢＭＳＣ邋ｇｒｏｗｉｎｇ邋ｓｔａｔｕｓ邋ｉｎ邋化ｅ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．邋Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋ａ：逡逑ＢＭＳＣ邋ｃｌｕｓ化ｒｓ邋ｊｏｉｎｅｄ邋化邋ｆｏｒｍ邋ｖｏｒｔｅｘ邋ａｒｒａｎｇｅ，邋ｂｅｉｎｇ邋ｍａｇｎ巧ｅｄ邋４０邋ｔｉｍｅｓ；邋Ｆｉｇｕｒｅ邋３－ｌｂ：艮ＭＳＣ邋ｉｓ逡逑ｓｐｉｎｄｌｙ，邋ｐｏｌｙｇｏｎａｌ邋ｏｒ邋ｓｔｒｅｔｃｈ邋ｏｕｔ邋ｍａｎｙ邋ｐｓｅｕｄｏｐｏｄ，邋ｂｅｉｎｇ邋ｍａｇｎｉｆｉｅｄ邋１００邋ｔｉｍｅｓ．逡逑３３逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R698

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