UQCRC1在二氮嗪延迟预处理心肌保护中的作用及其机制研究

发布时间：2019-11-15 03:11

【摘要】：目的：近年来，随着人口老龄化和我国医疗技术的发展，老年患者、心脏疾病行非心脏手术患者以及心脏手术患者逐年增多，围手术期心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)损伤的风险也相应增加。心肌缺血/再灌注损伤是围手术期患者并发症发生率和死亡率增加的重要原因[1]。因此，为围手术期患者提供有效的心肌保护仍是临床医生必须解决的难题。缺血预处理(Ischemia Preconditioning, IPC)是通过触发机体内源性抗损伤机制而增强心肌细胞对缺血缺氧的耐受能力。IPC的保护作用呈双相过程，第一相称为预处理的快速相，，出现在预处理的数分钟，持续1-3h。第二相称为预处理的延迟相(SecondWindow of Protection, SWOP)，出现在初次缺血后的12-72h。研究结果表明，IPC时心肌保护效果最强的时间位点是在延迟相[2][3][4]。围手术期麻醉药物，如吗啡等阿片类药、七氟醚和异氟醚等吸入性麻醉药等都能通过SWOP产生心肌保护作用[5][6][7]。然而，由于SWOP的作用机制尚未完全阐明，从而限制了SWOP在临床上的广泛应用。有蛋白质组学研究表明，SWOP可使心肌线粒体呼吸链中的多个蛋白表达上调[8]，这提示线粒体呼吸链的蛋白表达上调可能在SWOP中具有重要意义。泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome c reductase core protein1, UQCRC1)是线粒体呼吸链复合体Ⅲ上的一个亚单位，具有重要的生理功能。我们前期的蛋白质组学研究发现，UQCRC1的表达改变与大鼠心肌的SWOP呈正相关。由此，我们推测UQCRC1可能在SWOP中起了重要作用，它可能是又一新发现的保护性蛋白。近年来的研究结果表明，线粒体KATP通道是IPC和药物预处理如吗啡、舒芬太尼、七氟醚、异氟醚等延迟预处理的共同“终末效应器”[1][2][3][4]，开放线粒体KATP通道是它们产生心肌保护作用的共同信号通路。二氮嗪(Diazoxide, DZ)是线粒体KATP通道的特异性开放剂。因此，本研究选用二氮嗪的SWOP来研究UQCRC1在延迟预处理心肌保护中的作用及机制，具有很好的代表性。本研究采用腺病毒载体与RNA干扰技术，通过大鼠H9C2心肌细胞UQCRC1基因的过表达和表达沉默，并且建立氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation, OGD)模型模拟缺血/再灌注损伤，研究UQCRC1在二氮嗪延迟预处理H9C2心肌细胞抗缺血/再灌注损伤中的保护作用及其机制，为研发以UQCRC1作为分子靶点的心肌保护药物和阐明SWOP心肌保护的机制提供理论依据。方法： 1、本实验合成三种不同的siUQCRC1序列，采用RT-PCR和Western Blot等方法检测不同序列和不同浓度的siUQCRC1对UQCRC1基因和蛋白表达的影响,从中筛选出最有效的siUQCRC1序列和最佳有效浓度。 2、构建UQCRC1腺病毒载体，采用Western Blot法检测UQCRC1过表达、二氮嗪即时和延迟预处理后H9C2心肌细胞UQCRC1蛋白的表达，以及采用线粒体KATP通道特异性阻滞剂5-羟葵酸(5-hydroxydecanote,5-HD)进行干扰实验，观察SWOP后UQCRC1的表达水平及其与线粒体KATP通道开放的关系。 3、采用CCK-8法检测细胞存活率、Hoechst33342荧光标记凋亡细胞、四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester, TMRE)荧光染色标记线粒体膜电位等方法，观察SWOP对OGD损伤后H9C2心肌细胞存活率、细胞凋亡率和线粒体膜电位的影响及其与UQCRC1表达的关系。 4、采用Western Blot法检测H9C2心肌细胞Bcl-2、Bax及Cox-2蛋白表达，OGD损伤后active caspase-3的表达以及pho-Akt（Ser473）、Akt、pho-GSK3β（S9）、GSK3β蛋白的表达，观察SWOP和UQCRC1表达对心肌细胞保护性蛋白Bcl-2、Cox-2等表达、OGD损伤后caspase-3细胞凋亡信号和Akt/GSK-3β细胞保护信号激活的影响。结果： 1、靶序列为CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUQCRC1序列对UQCRC1mRNA的抑制作用最显著，该序列在转染浓度为200nmol/L时对UQCRC1蛋白的表达抑制作用最佳。 2、二氮嗪延迟预处理能显著上调UQCRC1蛋白的表达，其表达上调是通过开放线粒体KATP通道来实现的；采用5-HD使二氮嗪预处理时线粒体KATP通道关闭，则能完全消除二氮嗪延迟预处理后UQCRC1的表达上调，同时其心肌保护作用也随之消失。 3、SWOP是通过上调表达UQCRC1而产生心肌保护作用的。UQCRC1表达上调能显著增加OGD损伤后心肌细胞的存活率、减少细胞凋亡和保持线粒体膜电位；而抑制SWOP后的UQCRC1表达上调，则能完全消除SWOP对心肌细胞的保护作用。 4、SWOP通过上调H9C2心肌细胞UQCRC1的表达，继而使细胞保护性蛋白Bcl-2和Cox-2等表达增加、Bcl-2/Bax比率增高，从而产生保护效应；而下调UQCRC1表达能消除SWOP对心肌细胞Bcl-2和Cox-2蛋白表达的影响。 5、SWOP后心肌细胞UQCRC1的表达上调能显著抑制OGD损伤后active caspase-3蛋白的表达、增加磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白表达；下调UQCRC1的表达则能完全消除SWOP对active caspase-3、磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白表达的影响，同时也消除了OGD损伤后的心肌细胞保护。结论： 1、转染浓度为200nmol/L、靶序列为CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUQCRC1序列，能有效抑制H9C2心肌细胞UQCRC1的表达。 2、二氮嗪延迟预处理通过开放线粒体KATP通道而上调UQCRC1蛋白表达，从而对心肌细胞缺血/再灌注损伤起到保护作用。 3、上调Bcl-2、Cox-2等保护性蛋白的表达、抑制缺血/再灌注损伤后caspase-3凋亡信号通路激活、激活Akt/GSK-3β细胞保护信号通路，是UQCRC1在SWOP中抗心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用机制。 4、UQCRC1是SWOP中的保护性蛋白，它可能成为心肌保护的新靶点。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R614

【参考文献】