穿心莲内酯对ANIT诱导的大鼠肝损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2019-12-06 01:55

【摘要】：胆汁淤积是由胆汁生成障碍或/和胆汁流动障碍所致的一组疾病共同的临床症状,常见的病因包括胆道结石、肝胆恶性肿瘤、妊娠期肝内胆汁淤积、进行性家族遗传性肝内胆汁淤积症等。由于胆汁排出障碍,导致大量胆汁成分蓄积在肝细胞中,引起肝细胞氧化应激、炎症、凋亡和纤维化,如不进行有效干预,最终将演化为肝硬化。熊去氧胆酸是目前治疗胆汁淤积的唯一有效药物,但是对于原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化等特殊病例,仍缺乏有效的治疗手段。因此,急需开发一种高效低毒的胆汁淤积性肝疾病的有效药物。穿心莲内酯是中药穿心莲的主要活性成分,具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗心肌缺血、保护心脑血管、降血糖、免疫调节、保肝利胆等多种药理活性。临床上,相关制剂用于流行性感冒和肿瘤等疾病的治疗,在中国以及亚洲国家应用广泛。近年来,研究发现穿心莲内酯类化合物对化学毒剂和药物诱导的肝毒性具有显著的保护作用。但是,穿心莲内酯对ANIT诱导的大鼠胆汁淤积和肝损伤的作用及其相关机制尚未得到充分研究。第一部分:穿心莲内酯对ANIT诱导的大鼠肝损伤和胆汁淤积的保护作用目的:探讨穿心莲内酯对ANIT诱导的大鼠胆汁淤积和肝损伤的影响。方法:将36只健康成年雄性SD大鼠(体重180-220 g)随机分为以下6组:(1)空白溶剂对照组;(2)穿心莲内酯正常给药组(200 mg/kg);(3)ANIT组(50 mg/kg);(4)低剂量穿心莲内酯(50 mg/kg)+ANIT组(50 mg/kg);(5)中剂量穿心莲内酯(100 mg/kg)+ANIT组(50 mg/kg);(6)高剂量穿心莲内酯(200 mg/kg)+ANIT组(50 mg/kg)。穿心莲内酯混悬于0.5%CMC-Na中,以10 ml/kg体积灌胃给药,持续4天,每天上午一次。ANIT溶于食用橄榄油中口服灌胃给药,于第二天中午给予第3/4/5/6组大鼠50 mg/kg。第1组同时灌胃给予同容量溶媒。ANIT灌胃后48h,麻醉大鼠并腹主动脉取血,分离肝脏组织标本。应用试剂盒监测血清或肝组织中ALT、AST、ALP、γ-GGT、总胆汁酸和总胆红素等肝功、胆汁淤积标记物的含量水平。应用HE染色评价肝组织病理改变。结果:ANIT诱导大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GGT、总胆汁酸和总胆红素等生化指标显著升高,肝脏组织切片呈现病理样改变。应用穿心莲内酯预处理ANIT诱导的胆汁淤积大鼠,显著逆转大鼠肝功受损和胆汁淤积程度,肝组织病理改变减轻,表现出剂量依赖的肝保护作用。结论:穿心莲内酯对ANIT所致的大鼠肝损伤具有保护作用,减轻胆汁淤积程度。第二部分:穿心莲内酯通过抗炎和抗氧化活性逆转ANIT所致大鼠胆汁淤积和肝损伤目的:探讨穿心莲内酯逆转ANIT诱导的大鼠胆汁淤积和肝损伤的作用机制。方法:将36只健康成年雄性SD大鼠(体重180-220 g)随机分为以下6组:(1)空白溶剂对照组;(2)穿心莲内酯正常给药组(200 mg/kg);(3)ANIT组(50 mg/kg);(4)低剂量穿心莲内酯(50 mg/kg)+ANIT组(50 mg/kg);(5)中剂量穿心莲内酯(100 mg/kg)+ANIT组(50 mg/kg);(6)高剂量穿心莲内酯(200 mg/kg)+ANIT组(50 mg/kg)。穿心莲内酯混悬于0.5%CMC-Na中,以10 ml/kg体积灌胃给药,持续4天,每天上午一次。ANIT溶于食用橄榄油中口服灌胃给药,于第二天中午给予第3/4/5/6组大鼠50 mg/kg。第1组同时灌胃给予同容量溶媒。ANIT灌胃后48h,麻醉大鼠并腹主动脉取血,分离肝脏组织标本。应用试剂盒监测血清或肝组织中IL-6、TNF-α、MDA、SOD、GSH和GSH-PX等肝功、炎症和氧化标记物的含量水平。Western blot检测NF-κB、COX-2、SIRT1和Nrf2的表达水平。SIRT1 m RNA表达水平由real time PCR测定。结果:ANIT诱导大鼠血清中IL-6和TNF-α水平升高,NF-κB/COX-2表达上调。而且,ANIT升高大鼠血清中MDA水平,SOD、GSH和GSH-PX水平下调。穿心莲内酯剂量依赖的逆转ANIT所致血清炎症因子水平上调和NF-κB/COX-2通路激活,抑制炎症反应。最后,穿心莲内酯剂量依赖的逆转ANIT所致的MDA含量升高、GSH含量下降、以及SOD和GSH-Px活性下调,作用机制可能涉及上调大鼠肝脏中SIRT1和Nrf2的表达水平。结论:穿心莲内酯通过抗炎和抗氧化机制,对ANIT所致的大鼠肝损伤具有保护作用,减轻胆汁淤积程度。穿心莲内酯可作为治疗胆汁淤积性肝疾病的潜在药物加以开发和利用。
【图文】：

穿心莲内酯,大鼠肝组织

取大鼠血清进行生化指标测定。AND，穿心莲内酯。数据为 mean ±SD；n=6。p < 0.05 versus 正常对照组; # p < 0.05 versus ANIT 对照组。3.2 穿心莲内酯和 ANIT 处理对大鼠肝组织形态的影响为了更加直观的考察穿心莲内酯对 ANIT 所致大鼠肝损伤和胆汁淤积的影响，我们对穿心莲内酯和 ANIT 处理后大鼠肝组织形态进行了 HE 染色观察。光镜下，空白对照组肝小叶结构正常，肝细胞未见显著变化，汇管区、肝小叶、中央静脉结构清晰；ANIT 模型组失去正常的肝脏组织形态，呈显著病理损伤，表现为肝细胞肿胀、胞浆着色变浅、肝窦扩张且有明显的瘀血，伴炎症细胞浸润及坏死；穿心莲内酯组病理损伤与模型组比较明显改善，表现为坏死面积明显缩小或不明显，肝细胞肿胀程度减轻，胞核小，肝小叶边界明显，炎性细胞浸润显著减少，肝血窦和中央静脉间有少量瘀血（图 2）。正常大鼠给予穿心莲内酯不影响肝组织形态。

穿心莲内酯,相关因子,炎症,表达水平

图 3 穿心莲内酯和 ANIT 对大鼠炎症相关因子表达水平的影响。穿心莲内酯剂量依赖的逆转 ANIT 诱导的大鼠血清 IL-6（A）和 TNF-α（B）、肝组织 NF-κB 和 COX-2（C 和 D）表达上调。大鼠灌胃不同剂量穿心莲内酯（50、100、200 mg/kg）连续四天，第二天给予 ANIT（50 mg/kg），对照组灌胃等体积溶剂（0.5% CMC-Na 溶液和食用橄榄油）。ANIT 灌胃后 48h，，取大鼠血清和肝脏进行细胞因子测定和 western blot 实验。AND，穿心莲内酯。数据为 mean±SD；n=6。* p < 0.05 versus 正常对照组; # p < 0.05 versus ANIT 对照组。3.2 穿心莲内酯的抗氧化活性为了进一步揭示穿心莲内酯保护 ANIT 所致大鼠肝损伤的作用机制，我们考察了穿心莲内酯对 ANIT 所致氧化应激的影响。MDA 是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物，SOD 和 GSH-PX 是机体清除自由基抗氧化的重要代谢酶，GSH 也是机体抗氧化的内源性物质[29]。当机体出现炎症等刺激时，可发生抗氧化酶及抗氧剂的缺失，导致氧化剂增多，产生氧化应激和脂质过氧化
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5

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