促红细胞生成素衍生肽减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究

发布时间：2017-03-21 17:09

  本文关键词：促红细胞生成素衍生肽减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景近年来随着我国人口高龄化、高血压、糖尿病、血脂异常、肥胖、体力活动不足、不合理饮食等冠心病主要危险因素的增加,冠心病的发病率持续上升并呈现年轻化趋势。2012年《中国心血管病报告》数据显示：2002年至2011年间我国冠心病死亡率呈上升态势,2011年冠心病死亡率在城市为95.97/10万,农村为75.72/10万,并表现为城市高于农村,男性高于女性,而急性心肌梗死作为冠心病最为凶险的一种类型也表现出同样的发病趋势。对此如何及时有效的治疗急性心肌梗死成为降低冠心病病死率、改善预后的关键。目前认为,早期成功的再灌注治疗是挽救急性缺血心肌的关键。再灌注治疗包括溶栓治疗、经皮冠脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术,可以减小心肌梗死面积,改善心肌功能,降低死亡率,成为急性心肌梗死的重要治疗措施。然而,冠状动脉在血供迅速改善的同时可造成严重的心肌损伤,即心肌缺血再灌注损伤myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI),表现为严重的心律失常、内皮功能障碍、心肌顿抑、细胞死亡等,减少了再灌注血流所带来的获益。因此,如何有效减轻这种损伤,使再灌注治疗最大获益成为急性心肌梗死治疗的最大挑战。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白激素,因其良好的促进造血功能而广泛应用于临床。近十年来体内外大量的实验证实EPO还可作为一种保护因子,作用于机体多种组织器官,包括神经系统、心脏、肾脏等,通过减少细胞凋亡、抗氧化、抑制炎症反应、促血管生长等发挥其组织保护作用。其中,EPO在心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤等模型中良好的心肌保护作用更是受到广泛关注。但EPO需要大剂量才能发挥组织保护作用,会造成对骨髓造血系统的过度刺激,引起红细胞、血小板增多,使血液粘度增加、循环阻力增大,增大高血压和血栓形成的风险。近年来几个大型临床研究中,EPO因血栓及高血压等不良反应,使其临床推广受到限制。EPO有两种受体亚型：同源二聚受体(EPOR)2和异二聚体复合物EPOR-βCR。EPO的促红作用是由(EPOR)2受体介导的,而组织保护效应是由EPOR-βCR受体介导的。研究证实,敲除βcR基因可完全消除EPO对神经系统及心脏的组织保护作用；2008年Brines等根据这一特点,在与经典的促红受体(EPOR)2不结合的helix B段亲水表面筛选了11个氨基酸(序列为：QEQLERALNSS),合成了螺旋B表面肽(helix B surface peptide, HBSP),即促红细胞生成素衍生肽,并证实其具有神经组织保护作用而无促进红细胞生成的副作用。HBSP因其良好的临床应用前景而受到广泛关注,其在各种病理生理条件下的作用被广泛研究。有研究显示,HBSP能显著减轻小鼠肾脏缺血再灌注后肾小管上皮细胞损伤程度和凋亡水平。Ueba H等发现HBSP可以抑制TNF-a诱导的心肌细胞凋亡。Ahmet I等通过结扎前降支建立大鼠心梗后心衰模型,发现HBSP能够减慢大鼠心梗后心室重塑和心衰的进程,改善心功能,并降低死亡率。另一项研究表明,HBSP能减轻大鼠心肌梗死中的心肌细胞凋亡和炎症,减小心肌梗死面积,这一保护作用与ERK1/2, STAT3通路的激活有关。然而HBSP在心肌缺血再灌注损伤中是否起保护作用国外尚无相关报道,其作用机制尚不明确。本研究拟通过建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型,探讨HBSP后处理在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其可能机制,有望为HBSP的多种组织保护作用提出新的见解,为心肌缺血再灌注损伤的临床防治提供新的理论依据。研究目的1.建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型,证实HBSP后处理在心肌缺血再灌注损伤中的作用。2.探索HBSP在小鼠MIRI中发挥心肌保护作用的可能机制。研究方法1.研究对象及实验分组本实验选用SPF级ICR小鼠(雄性,体重25-30g)为研究对象。小鼠被随机分成4组：(1)假手术(sham)组：小鼠冠状动脉前降支只穿线但不结扎,在穿线40min时予腹腔注射生理盐水(10ml/kg);(2)缺血再灌注(MIRI)组：予行缺血再灌注处理,再灌前5min予腹腔注射生理盐水(10ml/kg);(3) HBSP组：予行缺血再灌注处理,再灌前5min予腹腔注射HBSP (90μg/kg, 10ml/kg);(4) HBSP+PD98059组：予行缺血再灌注处理,再灌前20min予腹腔注射ERK1/2特异性阻断剂PD98059 (1mg/kg),再灌前5min予腹腔注射HBSP (90μg/kg,10ml/kg)。2.小鼠MIRI模型的建立小鼠称重后经腹腔注射甲苯噻嗪(5mg/kg)及氯胺酮(100mg/kg)麻醉,仰卧位固定于手术台上,连接肢体心电图电极,描记标准Ⅱ导联心电图。经口行气管插管,连接小动物呼吸机。备皮并消毒后,经胸骨左缘第3-4助间行开胸术,暴露左心耳,在其下约1mm处,用8-0号缝线结扎冠状动脉左前降支,可见结扎线以下心肌变白。心电图实时监测并记录,ST段持续抬高说明造模成功,缺血45min后解除结扎线,再灌注120min。以ST段下移及缺血心肌渐恢复红润为再灌注成功标志。3.小鼠心肌梗死面积的测定再灌注2h后,原位结扎左前降支,采用伊文氏蓝和2,3,5—氯化三苯基四氮唑(TTC)双染法检测小鼠心肌梗死面积。缺血危险区(area at risk, AAR)为无蓝染的区域,梗死区域为白色,存活心肌被染成砖红色。用Image J图像分析软件测定心梗面积(infarct size, IS),计算危险区面积/左室面积(AAR/LV)及梗死面积/危险区面积(IS/AAR)的比值。4.血清LDH和CK的测定再灌注2h后,取心脏之前,经心尖取血0.5-1.0m1,以3000r/min离心10mmin,取血清于-20℃中保存备用。采用ELISA法检测各组乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)水平。5.心肌细胞凋亡的检测再灌注2h后,取心脏固定、包埋、切片,采用TUNEL检测试剂盒检测心肌细胞凋亡率,以LSM710型激光扫描共聚焦显微镜观察记录结果。每只小鼠计数10个随机高倍视野中TUNEL阳性细胞核数和总细胞核数。计算TUNEL阳性细胞核数占总细胞核数的百分比即为凋亡率。6.ERK1/2、磷酸化ERKl/2及cleaved caspase3表达的检测再灌注2h后,取结扎线以下左室心肌,将心肌组织剪碎研磨,加入细胞裂解液,提取总蛋白。蛋白定量后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转至PVDF膜上,采用5%脱脂牛奶封闭1h后分别加入各自稀释后的一抗,4℃共孵过夜,TBST洗膜两次,分别加入相应二抗(1：2000稀释),37℃孵育1h, TBST洗膜三次后,进行化学发光显影。采用Image pro plus 6.0软件分析目标条带光密度值。研究结果1. HBSP后处理减少小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面积再灌注2h后,与MIRI组相比,HBSP组心肌梗死面积明显缩小,HBSP+PD98059组心梗面积较HBSP组有所增加[三组IS/AAR分别为(47.1±7.4)%、(24.2±3.8)%和(38.4±2.2)%,P0.05],说明HBSP后处理能够减少小鼠MIRI后心肌梗死面积,而给予ERK1/2特异性阻断剂PD98059后,HBSP的这种保护作用被部分抑制。各组AAR/LV无明显差异(P0.05)。2. HBSP后处理减少小鼠心肌缺血再灌注后LDH和CK的释放再灌注2h后,MIRI组LDH水平明显高于sham组(878.2±133.0 vs.175.5±53.4U/L,P0.05)；而HBSP组与MIRI组相比,LDH明显降低(625.5±110.7vs.878.2±133.0U/L,P0.05); HBSP+PD98059组LDH较HBSP组有所升高(742±117.4 vs.625.5±110.7U/L, P0.05)。与sham组相比,MIRI组CK水平显著升高(P0.05)；而与MIRI组相比,HBSP组CK明显降低(P0.05)；HBSP+PD98059组CK较HBSP组有所升高(P0.05)。3. HBSP后处理减轻小鼠心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡再灌注2小时后,与sham组相比,MIRI组心肌细胞凋亡率明显升高(P0.05)；而同MIRI组相比,HBSP组细胞凋亡率明显降低(P0.05)；HBSP+PD98059组细胞凋亡率较HBSP组增加(P0.05),四组的细胞凋亡率分别为(5.5±1.1)%、(29.4+5.1)%、(15.0±2.3)%和(21.8±2.5)%。4. HBSP后处理抑制小鼠心肌缺血再灌注后的cleaved caspase3的表达再灌注2h后,MIRI组cleaved caspase3表达较sham组显著升高(1.75±0.21 vs.0.29±0.06,P0.05)；而HBSP组与MIRI组相比,cleaved caspase3表达明显降低(0.60±0.12vs.1.75±0.21,P0.05); HBSP+PD98059组cleaved caspase3表达较HBSP组有所升高(1.04±0.12 vs.0.60±0.12,P0.05)。5. HBSP后处理提高小鼠心肌缺血再灌注后ERK1/2的磷酸化水平再灌注2小时后,MIRI组磷酸化ERKl/2水平较sham组升高(P0.05)；与MIRI组相比,HBSP可以上调磷酸化ERK1/2的表达(P0.05)；而在给予ERKl/2特异性阻断剂PD98059后,ERKl/2的磷酸化被显著抑制(P0.05)。结论HBSP后处理可以减轻小鼠MIRI中的心肌细胞损伤,抑制心肌细胞凋亡,缩小心肌梗死面积,发挥心肌保护作用。其机制与ERK1/2通路的激活有关。
【关键词】：缺血再灌注损伤 促红细胞生成素衍生肽 细胞凋亡 ERK1/2
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 1.1 实验对象与材料23-25
• 1.2 实验方法25-43
• 1.3 结果43-49
• 1.4 讨论49-54
• 全文总结54-55
• 参考文献55-60
• 综述60-68
• 参考文献64-68
• 中英文缩略词对照表68-69
• 攻读学位期间成果69-70
• 致谢70-72

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 于竹芹;杨丽艳;刘广义;;脑缺血再灌注后CIDE-B表达与神经元凋亡的关系[J];中国医药科学;2013年17期

2 唐建勋;唐奕扬;张婕;赵华;程樟顺;刘忠良;;Cu、Pb联合毒性对泥鳅卵细胞基因表达影响的初步研究[J];广东微量元素科学;2014年03期

3 刘增超;袁建芬;胡磊;;无锡新区居民高血压患病及影响因素[J];公共卫生与预防医学;2014年03期

4 郝云霞;李庆印;李菀;梁洁;赵京媚;张辰;;心血管疾病住院患者跌倒现状调查[J];中国护理管理;2014年08期

5 丁舒;吴瑛;;心血管疾病预防护理的研究进展[J];中国护理管理;2014年08期

6 刘涛;李浪;;血小板调控CD4~+ T淋巴细胞与动脉粥样硬化关系的研究进展[J];广东医学;2014年21期

7 杨承志;田爱炬;孟增慧;吴济民;张幼怡;郭丽君;李子健;;异丙肾上腺素诱导FVB/N小鼠心脏肥大模型的建立[J];北京大学学报(医学版);2014年06期

8 杨名洋;张志坤;张晓慧;李芳;田玉芝;;唐山市玉田县高血压患病率调查及偏倚分析[J];公共卫生与预防医学;2014年06期

9 韦柳丽;韦美前;;高血压病防治中健康教育的应用与展望[J];中国医药科学;2015年01期

10 黄佳;周厚荣;;促红细胞生成素在窒息大鼠复苏后心功能不全的表达及干预作用的研究[J];贵州医药;2015年02期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘楠;Apelin对缺血—再灌注损伤导致的心脏功能障碍的保护作用及机制研究[D];第四军医大学;2013年

2 王先宝;黄芩苷预处理通过抑制线粒体损伤介导的凋亡保护心肌缺血再灌注损伤[D];南方医科大学;2013年

3 宋玉萍;津力达颗粒对糖尿病大鼠骨骼肌的保护作用及其机制研究[D];第二军医大学;2013年

4 王蕊;肾络通对梗阻性肾病大鼠氧化应激和细胞凋亡的影响[D];河北医科大学;2014年

5 耿巍;经前臂桡/尺动脉入径微创化冠状动脉介入治疗系列研究[D];河北医科大学;2014年

6 毛毳颖;左卡尼汀抗心肌细胞凋亡机制的实验研究[D];吉林大学;2014年

7 李荣;磺化PP无纺布血液相容性与吸附低密度脂蛋白性能研究[D];中国科学院研究生院（上海应用物理研究所）;2014年

8 周红敏;SUR2B/Kir6.1通道开放剂埃他卡林与高血压药物联用降压作用特征和纳他卡林对充血性心力衰竭的改善作用的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2014年

9 刘擎;Toll样受体拮抗剂中药对缺血性心血管病的作用与机制[D];广州中医药大学;2014年

10 石苗茜;α-亚麻酸改善高血压胰岛素抵抗大鼠血管内皮细胞损伤的作用和机制研究[D];第四军医大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张国权;益气活血利水方治疗慢性心衰的临床研究[D];北京中医药大学;2014年

2 胡毅林;慢性心力衰竭中医临床路径研究[D];福建中医药大学;2014年

3 朱晓华;微流控芯片的设计制备及用于内皮祖细胞生长行为的研究[D];西南交通大学;2014年

4 石红玲;急性冠脉综合征患者症状的性别差异[D];吉林大学;2014年

5 周朝锋;慢性心力衰竭患者血浆IL-18、IL-18BPa、IL-37的变化及其与心功能的相关性研究[D];广西医科大学;2014年

6 张德磊;吉林省长春市2120名中学生高血压发病情况及相关因素分析[D];吉林大学;2014年

7 王建康;绝经后女性性激素水平与冠状动脉粥样硬化程度相关性研究[D];苏州大学;2014年

8 龚福汉;高甘油三酯腰围表型与动脉硬化的相关性研究[D];昆明医科大学;2014年

9 黄军;洋地黄对急性心肌梗死合并急性心力衰竭的左室重塑及胶原代谢的影响[D];南方医科大学;2014年

10 刘良;基于生物阻抗技术的心血管功能检测的研究[D];燕山大学;2014年

  本文关键词：促红细胞生成素衍生肽减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：259996