PKMζ-Kalirin-7介导突触可塑性在大鼠瑞芬太尼痛觉过敏中的调控机制

发布时间：2020-05-07 01:32

【摘要】：阿片类药物(Opioids)主要被用于临床麻醉、急慢性痛和癌性痛的治疗。其引发的痛敏效应因与其镇痛初衷相悖,很大程度上制约了Opioids的临床使用。瑞芬太尼(Remifentanil)常用于临床复合麻醉,但多篇文献报道其镇痛作用消除快使瑞芬太尼诱发痛觉过敏(RIH)的发生率显著高于其他Opioids。因此明确RIH发生的关键性分子机理并寻找确切的治疗靶点具有重要意义。蛋白激酶Mζ(PKMζ)是非典型PKC家族成员,具有固有活性,其处于持续活化状态是保持突触效能的重要机制。有研究证实,PKMζ调节突触结构重塑和AMPA受体功能诱导并维持突触功能重塑是神经病理性痛和炎性痛中枢敏化的关键环节。Kalirin是一类兴奋性突触神经元胞质内的蛋白分子,在协调树突棘数量、突触发育、学习记忆等过程中发挥重要作用。其中,Kalirin-7与AMPA受体信号传导系统关系最为密切。最新研究发现,Kalirin-7也参与了疼痛相关的兴奋性神经突触重塑,介导痛觉信息的储存,形成并巩固痛觉敏化。故我们推测PKMζ通过Kalirin-7介导树突棘结构重塑和AMPA受体功能可能是RIH的发生机制。本研究拟建立大鼠在体切口痛—RIH模型和体外孵育瑞芬太尼模型,探讨PKMζ和Kalirin-7对RIH大鼠脊髓背角兴奋性神经突触结构和功能重塑的分子机理,从而为临床合理有效地防治瑞芬太尼引发痛觉过敏提供新的靶点。目的通过评价切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角PKMζ活性、Kalirin-7表达和AMPA受体转运水平的变化,探讨其在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的可能机制;通过鞘内注射PKMζ选择性抑制剂ZIP,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角Kalirin-7表达和AMPA受体转运的影响;通过鞘内注射kalirin-7-shRNA基因沉默kalirin-7,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛阈和AMPA受体转运的影响;通过鞘内注射GluA1选择性拮抗剂NASPM,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛阈的影响;通过鞘内注射ZIP和kalirin-7-shRNA抑制PKMζ和Kalirin-7,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角树突棘形态学的影响;探讨PKMζ和Kalirin-7在瑞芬太尼诱发大鼠脊髓背角神经元AMPA受体微小兴奋性突触后膜电流(mEPSCs)中的作用。方法一雄性SD大鼠44只(240~260g),随机分为4组(n=11):C组(假手术+生理盐水组):假手术,生理盐水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;I组(切口痛组):建立Brennan切口痛模型;R组(Remifentanil组):瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;IR组(Remifentanil+切口痛组):建立Brennan切口痛模型,瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足阈值(PWT);于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L_(4-6)节段,采用免疫组化和Western Blot法测定PKMζ活性、Kalirin-7表达和AMPA受体转运水平。二雄性SD大鼠66只(240~260g),随机分为6组(n=11):C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;C+Z_3组:鞘内注射ZIP 100nmol后即刻开始静脉输注生理盐水;Z_1,Z_2,Z_3组:分别鞘内注射ZIP 1nmol,10nmol,100nmol后即刻开始输注瑞芬太尼。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定PWL和PWT;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L_(4-6)节段,采用Western Blot法测定Kalirin-7表达和AMPA受体转运水平。三雄性SD大鼠44只(240~260g),随机分为4组(n=11):C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;C+kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8 transducing units[TU]/mL),2周后待转染成功,生理盐水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;IR+kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8 transducing units[TU]/mL),2周后待转染成功,瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定PWL和PWT;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L_(4-6)节段,采用Western Blot法测定PKMζ活性和AMPA受体转运水平。四雄性SD大鼠66只(240~260g),随机分为6组(n=11):C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;C+N_3组:鞘内注射NASPM 100μg后即刻开始静脉输注生理盐水;N_1,N_2,N_3组:分别鞘内注射NASPM 1μg,10μg,100μg后即刻开始输注瑞芬太尼。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定PWL和PWT;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L_(4-6)节段,采用Western Blot法测定AMPA受体转运水平。五雄性SD大鼠16只(240~260g),随机分为4组(n=4):C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg~(-1)·min~(-1),1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;IR+ZIP组:瑞芬太尼输注前鞘内注射ZIP 100nmol;IR+kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8transducing units[TU]/mL),2周后待转染成功,建立Brennan切口痛模型并输注瑞芬太尼。于输注后2 d,处死全部大鼠并取脊髓背角L_(4-6)节段,采用高尔基染色法测定树突棘的长度和数量。六取出生5-7周的SD大鼠16只,随机分为4组(n=4):C组:取脊髓(L_(4-5)),制备脊髓片,人工脑脊液孵育1h;R组:使用含有瑞芬太尼(4 nM)的人工脑脊液中孵育脊髓片1h;ZIP组:制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼(4 nM)和ZIP(5μM)的人工脑脊液中孵育1h;kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA(10μL;3×10~8 transducing units[TU]/mL),2周后待转染成功,制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼(4 nM)的人工脑脊液中孵育1h。全细胞膜片钳技术评价大鼠脊髓背角神经元AMPA受体的电生理功能。结果一与C组相比,I、R和IR组的PWT和PWL降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表达增多;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加(P0.05)。与I组相比,IR组的PWT和PWL显著降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表达增多;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加(P0.05)。各组GluA2表达和转运水平均无显著差异(P0.05)。二与C组比较,IR、Z_1、Z_2、Z_3组的PWT和PWL明显降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表达增多;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加(P0.05)。与IR组相比,Z_2和Z_3组的PWT和PWL明显升高,PKMζ磷酸化水平降低;Kalirin-7表达下调;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运减少,且存在剂量依赖(P0.05)。三与C组比较,IR和IR+kalirin-7-shRNA组的PWT和PWL明显降低;PKMζ磷酸化水平升高;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加(P0.05)。与IR组相比,IR+kalirin-7-shRNA组的PWT和PWL明显升高;膜/总蛋白中GluA1的表达减少(P0.05);但PKMζ磷酸化水平未见显著性改变(P0.05)。四与C组比较,IR、N_1、N_2、N_3组的PWT和PWL明显降低;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加(P0.05)。与IR组相比,N_2和N_3组的PWT和PWL明显升高,膜蛋白中GluA1的表达减少,且存在剂量依赖(P0.05)。五与C组比较,IR、IR+ZIP和IR+kalirin-7-shRNA组的树突棘的数量和长度均显著增加(P0.05)。与IR组相比,IR+ZIP和IR+kalirin-7-shRNA组的树突棘数量和长度明显减少(P0.05)。六与C组比较,R、ZIP和kalirin-7-shRNA组AMPA-mEPSCs的振幅和频率升高(P0.05)。与R组比较,ZIP和kalirin-7-shRNA组振幅和频率降低(P0.05)。结论瑞芬太尼麻醉可加重切口痛导致的术后痛觉过敏现象;切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角PKMζ活性升高、Kalirin-7合成增多及GluA1靶向突触后膜转运增加;抑制脊髓水平PKMζ对大鼠瑞芬太尼机械痛敏和热痛敏具有预防作用,其机制可能是下调脊髓背角Kalirin-7表达和AMPA受体转运;抑制脊髓水平kalirin-7对大鼠瑞芬太尼机械痛敏和热痛敏具有预防作用,其机制可能是下调脊髓背角AMPA受体靶向突触后膜转运;抑制脊髓水平GluA1靶向突触后膜转运对大鼠瑞芬太尼机械痛敏和热痛敏具有预防作用;瑞芬太尼麻醉后可引起脊髓背角PKMζ和Kalirin-7活化,从而调控树突棘结构重塑,可能是RIH发生的关键;瑞芬太尼孵育后可上调PKMζ和Kalirin-7活性,进而介导兴奋性谷氨酸能神经突触功能重塑,这可能是瑞芬太尼痛觉过敏的核心机制。
【图文】：

突触可塑性

增强对外周传入冲动的突触反应进而“学习”新的信息，形成记忆并储存这信息在中枢突触。蛋白激酶 Mζ (protein kinase Mζ, PKMζ) 是非典型蛋白 (protein kinase C, PKC) 家族成员。蛋白激酶 Mζ 只有独立催化域，缺乏，无自身抑制功能，故具固有活性，，是突触重塑诱导和维持的靶控蛋白习记忆过程中具有关键作用[36-39]。有研究证实，NMDA 受体活化引起钙细胞内大量的涌入，激活钙调蛋白激酶 (Calmodulin-dependent protein kinaMKⅡ) 等下游靶点蛋白从而使蛋白激酶 Mζ 的翻译阻滞被有效快速解磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1（Phosphoinostide-dependent kinase1, PDK1）蛋白激酶 Mζ，使其改变构象，从而使蛋白激酶 Mζ 从刚合成的低活性状为高活性状态，进而高效参与下游靶点分子的激活，最终调节 AMPA 受改变和功能活化诱导和维持突触可塑性改变（图 1）[40]。新近研究报道，酶 Mζ 也参与了疼痛相关中枢兴奋性神经突触重塑，介导痛觉信息的储并巩固“痛觉记忆”，是调控神经病理性痛和炎性痛中枢敏化的重要机制]。但 PKMζ-AMPA 受体膜上位（membrane insertion）是否诱发并介导瑞痛敏记忆形成，有待研究。

树突棘,突触,瑞芬太尼,痛敏

PKMζ 的神经元成熟树突棘（蘑菇状）数量增多，有利于形成功能性突触，促进 AMPA 受体在突触后膜定位，增强 mEPSCs，维持突触功能可塑性及突触间信息传递。Kalirin 是一类兴奋性神经突触胞质内的蛋白分子，生物功能主要有激发神经元突起生长、增加树突棘数量，在协调突触发育和学习记忆中扮演重要角色[51, 52]。其中，Kalirin-7 与兴奋性谷氨酸受体系统关系最为密切，多篇文献证实 Kalirin-7 可直接介导 AMPA 受体膜上位参与突触可塑性和记忆形成[53-55]。Xie 等[56]报道 NMDA 受体活化后，可以促进 CaMKⅡ依赖的 Kalirin-7表达和磷酸化，Kalirin-7 活化后可直接调控 GluA1 亚基膜转位，增强 AMPA 受体介导的 mEPSCs，促进树突棘增大，增加成熟树突棘数量，形成功能性突触，维持突触重塑。而激活 CaMKⅡ也可促进 PKMζ 表达和活化，调控相关靶蛋白磷酸化，介导下游 AMPA 受体膜上位，维持突触效能[57]。故我们推测 PKMζ—Kalirin-7 介导突触重塑可能参与 RIH 发生（图 2）。因此，本研究拟通过建立切口痛-瑞芬太尼痛敏大鼠模型，探讨兴奋性突触结构和功能可塑性改变在 RIH中的分子机理，为其临床防治提供新的靶点。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

【参考文献】