丘脑皮层环路HCN离子通道和GABAA受体参与丙泊酚全麻效应及机制研究

发布时间：2020-05-10 17:57

【摘要】：研究背景:全麻药物的作用机制一直是亟待解决的重要科学问题。近年的研究表明,在中枢神经系统中,尤其是大脑皮层和丘脑,广泛表达的一种超极化激活的钾离子通道,HCN离子通道,可能与传统的GABAA受体共同参与静脉麻醉药物的全麻效应,但是两者对静脉麻醉药物的麻醉效应的影响以及其两者之间是否存在相互作用尚不清楚。目的:首先明确HCN通道以及GABAA受体在小鼠大脑皮层及丘脑的表达,其次通过药理学方法观察HCN通道阻断剂ZD-7288和GABAA受体激动剂GABA对丙泊酚诱导小鼠失去翻正反射的影响,明确两者对丙泊酚全麻效应的影响以及探讨两者是否存在相互作用,方法:C57/BL6雄性小鼠,体重22±2g,采用RT-PCR的方法检测小鼠皮层和丘脑中HCN离子通道和GABAA受体的表达,行为学检测采用尾静脉注射丙泊酚诱导小鼠失去翻正反射(loss of righting reflex,LORR)的方法,计算正常情况下小鼠LORR时丙泊酚的半数有效剂量(median effective concentration,EC50),随后观察比较侧脑室注射不同剂量的HCN通道阻断剂ZD-7288以及GABAA受体激动剂GABA对丙泊酚诱导小鼠LORREC50的影响,同时观察侧脑室单独注射ZD-7288和GABA时对小鼠LORR的影响,使用药理学方法评估HCN通道与GABAA受体相互之间的作用,免疫共沉淀方法检测HCN通道与GABAA受体的共沉淀情况。结果:HCN1、HCN2通道显著表达于小鼠大脑皮层及丘脑,而HCN3和HCN4通道表达量较低。侧脑室注射不同的剂量的ZD-7288(0～50μg)可以使丙泊酚诱导的小鼠LORR的EC50剂量显著降低;在侧脑室注射不同剂量的GABA(0～150μg)时,观察到了相同的现象,GABA可以显著降低丙泊酚诱导的小鼠LORR的EC50剂量。更加有趣的是,侧脑室单独使用ZD-7288(50μg)和GABA(150μg)同样可以诱导小鼠LORR,表明侧脑室注射ZD-7288或者GABA可以模拟丙泊酚诱导的全麻效应。同时,使用药理学的方法证实,HCN离子通道和GABAA受体对于小鼠LORR具有协同作用,免疫共沉淀结果提示在大脑皮层以及丘脑HCN1、HCN2通道与GABAA受体均存在共表达现象。结论:丙泊酚诱导小鼠LORR的全麻效应与HCN离子通道与GABAA受体密切相关,HCN离子通道与GBAAA受体在丙泊酚诱导小鼠的全麻效应中具有协同作用。研究背景:随着对全麻原理研究的深入,发现全麻药物在微观分子水平的作用与其宏观作用存在很多不一致性。最新的研究表明脑电活动的变化与全麻效应有关,尤其是全麻药物对低频脑电的影响被认为与全麻效应关系密切。HCN通道与GABAA受体被认为是参与低频脑电产生的重要媒介,但确切机制尚不明确。目的:通过描记动物脑电图,观察丙泊酚、HCN离子通道阻断剂和GABAA受体激动剂对低频脑电活动尤其是慢波振荡的影响,分析HCN离子通道和GABAA受体在丙泊酚引起的脑电慢波振荡(1 Hz)的作用。方法:首先,为明确静脉注射丙泊酚对小鼠脑电活动的影响,成年C57/BL6,体重22±2g,使用头皮下埋入金属电极的方法,分别于小鼠大脑额叶部位植入一枚金属电极,枕叶部位植入两枚金属电极,其中一枚电极为参比电极。尾静脉注射丙泊酚后,迅速连接脑电记录系统,观察小鼠脑电活动的变化。随后,观察侧脑室注射HCN通道的阻断剂ZD-7288与GABAA受体的激动剂GABA对丙泊酚引起小鼠脑电图变化的影响。最后,探讨ZD-7288和GABA各自对小鼠脑电图的影响以及同时作用时小鼠脑电活动的变化。结果:尾静脉注射丙泊酚呈剂量依赖性地显著增强小鼠的脑电慢波振荡,侧脑室注射ZD-7288或GABA可显著增强丙泊酚引起的脑电慢波振荡。侧脑室注射单独注射ZD-7288 或 GABA 也可诱导小鼠出现脑电慢波振荡增强的现象,并呈剂量依赖性。通过分析比较侧脑室注射诱导小鼠失去翻正反射的EC50剂量的ZD-7288和GABA对小鼠脑电慢波振荡的影响,表明丙泊酚增强小鼠脑电慢波振荡的效应源于HCN通道与GABAA受体的协同作用。结论:静脉注射丙泊酚均可诱导小鼠出现脑电慢波振荡,侧脑室注射HCN通道阻断剂ZD-7288以及GABAA受体激动剂GABA显著增强这种效应。HCN离子通道和GABAA受体共同参与丙泊酚引起小鼠出现的脑电慢波振荡。研究背景:全麻药物诱导的全麻状态被认为与脑电活动的变化有关,其中起源于丘脑皮层环路的脑电慢波振荡与全麻状态相关性最高。HCN通道和GABAA受体在丘脑皮层环路中的各类神经元中广泛表达,在调控丘脑皮层环路中的信号传递中具有重要作用。但是,其具体如何调控丘脑皮层环路的信号传导尚不清楚。目的:明确HCN通道与GABAA受体在丘脑皮层环路中的细胞定位;观察丙泊酚、ZD-7288和GABA对丘脑皮层环路中的皮层锥体神经元与丘脑网状核神经元的静息膜电位、膜输入阻抗、兴奋性突触后电流(EPSC)和抑制性突触后电流(IPSC)的影响,同时检测它们对皮层锥体神经元和丘脑网状核神经元之间信号传递的影响。并分析HCN通道和GABAA受体归功于其中的作用。方法:运用免疫荧光技术,标记HCN通道与GABAA受体在丘脑皮层环路中的细胞定位;采用全细胞膜片钳记录的方法,分别记录小鼠皮层第V层锥体神经元以及丘脑网状核神经元的静息膜电位、膜输入阻抗、兴奋性突触后电流和抑制性突触后电流,并观察丙泊酚,ZD-7288和GABA对这些指标的影响。同时采用电刺激技术,刺激丘脑网状核神经元,在皮层锥体神经元记录刺激诱发的突触后电流,并观察丙泊酚、ZD-7288 和 GABA 对其的影响。结果:HCN1、HCN2通道与GABAA受体在皮层第V层锥体神经元和丘脑网状核神经元广泛共表达;丙泊酚、ZD-7288和GABA可显著增加皮层第V层锥体神经元和丘脑网状核神经元的的静息膜电位,升高膜输入阻抗,同时增强抑制性突触后电流的频率与幅值。而丙泊酚、ZD-7288和GABA对兴奋性突触后电流的影响不大。采用电刺激技术刺激丘脑网状核神经元时,在皮层第V层锥体神经元可记录出诱发的抑制性突触后电流,丙泊酚、ZD-7288和GABA均可显著增强诱发的抑制性突触后电流的强度。结论:丘脑皮层环路在丙泊酚的全麻效应中具有重要作用,HCN通道以及GABAA受体参与丘脑皮层环路抑制性电信号的传导。
【图文】：

翻正反射,侧脑室注射,小鼠

图３．侧脑室注射分别注射ＺＤ－７２８８和ＧＡＢＡ对小鼠翻正反射的影响。Ａ：侧脑室注射ＺＤ－７２８８可逡逑诱导小鼠失去翻正反射。Ｂ：侧脑室注射ＧＡＢＡ可诱导小鼠失去翻正反射。逡逑３．４邋ＺＤ－７２８８与ＧＡＢＡ在诱导小鼠ＬＯＲＲ效应中具有协同作用逡逑

小鼠,翻正反射,药理学,侧脑室注射

华中科技大学博士学位论文逡逑ＥＣ５０使ＧＡＢＡ诱导小鼠ＬＯＲＲＥＣ５０显著降低（图４Ｃ和Ｄ，，从８６．４０±４．１７邶减少逡逑到４０．９１邋±３．４５昭），同样，侧脑室注射ＧＡＢＡ的ＬＯＲＲＥＣ５０也使得ＺＤ－７２８８的ＬＯＲＲ逡逑ＥＣ５０明显降低（图４Ａ和Ｂ，从３０．２０±１．８１邋（ｘｇ降低至１４．３３邋±０．９４盹）。随后，通过逡逑药理学方法分析证实，ＺＤ－７２８８和ＧＡＢＡ在诱导小鼠ＬＯＲＲ时存在药理学上的协同逡逑作用（４０．９１邋±３．４５／邋８６．４０邋±４．１７＋１４．３３邋±邋０．９４／３０．２０邋±邋１．８１＝邋０．９４＜１）
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

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