CaMKⅡ在大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡中的初步研究

发布时间：2020-06-06 05:56

【摘要】：第一部分大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析[目的]探讨大鼠DCD供体原位肝移植模型稳定建立的技巧及其经验总结。[方法]通过改良Kamada“二袖套”法,对三组(A组热缺血0min40对,B组热缺血10min40对,C组热缺血20min40对)SD大鼠施行原位肝移植,术后记录分析大鼠24h,72h,7天生存率和死亡原因。[结果]术后24h生存率A组92.5%,B组90.0%,C组92.5%;术后72h生存率A组 90.0%,B 组 80.0%,C 组 77.5%;术后 7 天生存率 A 组 85.0%,B 组 70.0%,C组57.5%。3组术后24h和术后72h生存率差异均无显著性(p0.05)。但3组术后7天生存率不全相同(p0.05)。7天生存率C组比A组显著降低(p=0.0167)。术后24h内死亡原因多为手术操作不足,术后胆漏、缺血性肝衰竭多在24h-72h死亡,手术3天-7天死亡原因多为胆道并发症,且随着热缺血时间的延长,胆道并发症的发生率增高。[结论]建立了稳定的大鼠DCD原位肝移植模型。大鼠DCD原位肝移植模型的稳定建立关键在于保护肝脏和胆道功能,难点在于肝上下腔静脉的吻合和缩短无肝期。第二部分热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMKⅡ、肝细胞凋亡及线粒体凋亡的关系[目的]研究在大鼠DCD原位肝移植中,供肝不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植术后CaMK Ⅱ和肝细胞凋亡、线粒体凋亡的关系[方法]建立大鼠DCD肝移植模型,A组(热缺血Omin)、B组(热缺血1Omin)、C组(热缺血20min),三组分别于肝移植术后1d、3d、7d随机处死6只大鼠,取肝细胞流式细胞技术AnnexinV-FITC/PI标记测肝细胞凋亡率和JC-10标记测肝细胞线粒体膜电位水平,取肝组织标本QRT-PCR测肝组织CaM mRNA、CaMK Ⅱ γmRNA定量,Western blot测肝组织CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝细胞质CytC、AIF定量。[结果]术后3天,7天,肝细胞JC-10标记测得绿色荧光细胞百分比C组较A组、B组升高,(P0.05)。B组较A组高(P0.05)。三组术后同一时间点细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死率C组较B组和A组高,B组较A组高(p0.05)。CaM、CaMKⅡγ、CytC、AIF表达量术后一天各组间差异无显著性,术后3天、7天C组高于B组和A组(P0.05),而B组高于A组(P0.05)。[结论]在大鼠DCD原位肝移植中,随着供肝经历热缺血时间的延长,术后肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡逐渐增加,肝细胞质CytC、AIF表达量,肝组织CaM、CaMKⅡ表达量逐渐上调。提示CaM、CaMKⅡ与大鼠DCD肝移植术后细胞及线粒体凋亡相关,并在大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡途径的细胞凋亡中起着十分关键的作用。第三部分CaMK Ⅱ表达在大鼠DCD肝移植术后细胞和线粒体凋亡中的初步研究[目的]探究CaMK Ⅱ在大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡中的作用。[方法]通过建立热缺血10min的大鼠DCD原位肝移植模型,注射靶向CaMK Ⅱγ基因、CaMKⅡγ-shRNA慢病毒转染,上调和下调模型肝细胞CaMKⅡ表达量。1B组(生理盐水空白组),2B组(CaMK Ⅱγ过表达空载体组),3B组(CaMK Ⅱγ过表达组),4B组(CaMK Ⅱγ干扰表达空载体组),5B组(CaMK Ⅱγ干扰表达组),于术后1天、3天、7天、30天随机处死3只大鼠,流式细胞技术测肝细胞凋亡率和肝细胞线粒体膜电位水平,取肝组织标本QRT-PCR测肝组织CaMmRNA、CaMK ⅡγmRNA定量,Western blot检测肝组织CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝细胞质CytC、AIF定量。[结果]五组术后同一时间点肝细胞JC-10标记测得绿色荧光细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死细胞率3B组明显高于1B和2B组(P0.05),5B组明显低于1B组和4B组(P0.05),而1B、2B、4B差异无显著性(P0.05)。CaM、CaMK Ⅱγ、CytC、AIF表达量术后一天各组间差异无显著性,术后3天、7天、30天3B组明显高于1B和2B组(P0.05),5B组明显低于1B组和4B组(P0.05),而1B、2B、4B差异无显著性(P0.05)。[结论]大鼠DCD原位肝移植术后自大鼠阴茎背静脉注入慢病毒进行转染,此方法简单、安全、有效。在大鼠DCD原位肝移植中,上调肝细胞CaMKⅡγ表达量后,移植肝肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡率升高。反之,干扰下调肝细胞CaMKⅡ表达后,移植肝肝细胞线粒体凋亡和细胞凋亡率降低。反应了CaMKⅡ参与大鼠DCD原位肝移植术后肝细胞线粒体凋亡及细胞凋亡过程的调控。由此推断,在DCD肝移植术后,若能特异性阻断CaMK Ⅱ信号通路,则可达到减少肝细胞凋亡的目的。
【图文】：

支撑管,胆管,门静脉,保存液

依次剪断肝镰状韧带、肝左三角韧带、肝后韧带、肝胃韧带。紧贴ＳＨＹＣ用８－０逡逑^6针缝线缝扎左隔下静脉，５－０丝线结扎肝食管静脉丛。游离胆总管，于肝管汇逡逑合处远端约０．８－１邋ｃｍ处剪一斜口，胆管支撑管自斜口插入胆管（图５）约０．４ｃｍ，逡逑５－０丝线结扎固定，并预留约ｌｃｍ线头。游离门静脉及其分支、肝动脉，并切断逡逑肝动脉。结扎脾静脉，于肠系膜上、下静脉分叉处剪断门静脉，形成喇叭口状。逡逑钝性分离ＩＨＶＣ至左肾静脉处，分别结扎切断右肾静脉、右肾上腺静脉、腰静逡逑脉，在左肾静脉与下腔静脉交叉处剪断ＩＨＶＣ。剪断右三角韧带和肝脏背面韧逡逑带，，紧贴脑肌环剪断肝上下腔静脉（ｓｕｐｒａｈｅｐａｔｉｃｖｅｎａｃａｖａ，ＳＨＶＣ），保持断端逡逑平整。取出供体肝脏，置于0－４°Ｃ保存液中。逡逑２．２．３供肝的修整逡逑供肝置于0－４°Ｃ保存液中。单人套管，弯蚊式钳夹住门静脉套管柄，蚊式钳逡逑柄固定于橡皮泥上

套管,门静脉,保存液,橡皮泥

供肝置于0－４°Ｃ保存液中。单人套管，弯蚊式钳夹住门静脉套管柄，蚊式钳逡逑柄固定于橡皮泥上，套管固定，用显微血管钳伸入套管中将门静脉轻轻拉出反逡逑套于套管上，５－０丝线固定。同理完成ＴＨＶＣ的套管（图６）。ＳＨＶＣ左右两个逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R657.3

【参考文献】