GABA-A受体介导的KLF4对癫痫的调控机制的研究

发布时间：2020-06-16 04:32

【摘要】：近年来,围术期医学和麻醉治疗学在整个医疗过程中发挥越来越重要的作用,越来越多的癫痫患者的麻醉治疗和围术期管理对麻醉医师提出了新的挑战。癫痫(Epilepsy)是一类以反复的癫痫性发作为特点的神经系统疾病的总称,中枢神经系统(CNS)多部位神经元同步异常放电是其最显著的生理特点。全球癫痫患病率达到0.5%-1%,我国目前约有900万癫痫患者。癫痫患者常并发其他各类认知障碍,心境障碍及躯体运动障碍。目前,临床上癫痫治疗可采用药物治疗、手术治疗等手段。癫痫手术治疗的麻醉难度较高。镇静类麻醉药物对自发性脑电活动有较大影响,且许多麻醉药物与抗癫痫药物具有相同的作用位点,术中麻醉药物选择不当可能诱发癫痫发作。因而,癫痫手术中应选择适当的麻醉方案,既要减少对皮层脑电图(ECo G)的不适当激发或抑制,保证致痫灶的定位准确,也要避免术中麻醉药诱发的癫痫发作。然而,药物治疗和手术治疗都仅能控制癫痫发作,并不能预防由脑损伤等外部因素诱发的继发性癫痫形成。流行病学调查显示,癫痫具有一定的家族倾向性,说明遗传因素对于癫痫形成具有一定的影响。因此,从分子水平探讨癫痫的发生机制,寻找预防或延缓初始促发性损伤后(IPI)的慢性癫痫发生,同时为癫痫患者的围术期管理、麻醉治疗及必要的神经保护策略提供新的分子靶标具有非常重要的意义。Kruppel-Like Factor 4(KLF4),属于Kruppel样转录因子蛋白家族的一员,是真核生物锌指蛋白转录因子,其最早被发现表达在口腔、胃肠等消化道的上皮细胞中。KLF4对胚胎细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要的调节作用。近年来,陆续有研究发现KLF4在神经系统中也有表达,并参与调控神经干细胞分化、轴突生长等关键事件,提示其可能参与了自闭症、先天性脑积水和脑瘫等神经系统发育性疾病的发生。目前,未见国内外有关研究报道KLF4在癫痫发作及慢性癫痫形成中的作用。基于此背景,本研究对KLF4对癫痫的调控机制展开研究。目的:KLF4是最近进入神经生理学家视野的一个转录因子,其在胚胎发育时期对神经系统的分化和增殖的调控作用引起了国内外学者的关注。传统抗癫痫药物对癫痫病的治疗具有较大的局限性,寻找有效的分子靶点进行干预,控制癫痫发作,预防脑损伤后的慢性癫痫形成已成为神经学领域研究的热点及难点问题。本课题提出了科研问题,KLF4是否影响癫痫的发作,KLF4是否参与戊巴比妥诱导的睡眠活动的调控,旨在通过解决这些问题,阐明转录因子KLF4和癫痫的关系,同时对KLF4在癫痫以及睡眠活动中的调控作用进行初步探讨。通过本研究为防治慢性癫痫发生、发展,同时也为癫痫患者的围术期管理、麻醉治疗及必要的神经保护策略提供理论依据。GABA-A受体介导的KLF4在癫痫发作中的影响方法:1.选取16只健康ICR雄性小鼠,随机分为对照组和癫痫模型组(PTZ)。利用免疫印记的方法对小鼠海马KLF4的表达进行测定。2.选取24只健康ICR雄性小鼠,随机分为PTZ组、PTZ+VPA组和PTZ+CBZ组,每组各8只。观察戊四唑给药后20min内小鼠癫痫发作行为的变化。并且,利用免疫印记的方法对小鼠海马KLF4的表达进行测定。3.选取32只健康ICR雄性小鼠,随机分为PTZ组、VPA组、蝇蕈醇(Mus)组和氟马西尼(Flu)组。观察PTZ给药后20min内小鼠癫痫发作行为的变化。并且,利用免疫印记的方法对小鼠海马KLF4的表达进行测定。结果:1.比较对照组和PTZ急性给药组,PTZ组小鼠海马KLF4的表达降低。2.抗癫痫药物丙戊酸钠和卡马西平均能够显著延长戊四唑诱导的急性癫痫持续状态的发作潜伏期。而比较两组发现,VPA组的潜伏期长于CBZ组。丙戊酸钠和卡马西平均能够显著降低小鼠癫痫发作等级并且促进小鼠海马KLF4表达。且比较两组发现,CBZ组KLF4表达高于VPA组,并具有统计学差异。3.丙戊酸钠灌胃能够显著延长小鼠的癫痫发作潜伏期,氟马西尼腹腔注射能够显著拮抗这种作用,Flu组的癫痫发作潜伏期显著低于VPA组。Mus组较VPA组的癫痫发作潜伏期无统计学差异。Flu组小鼠的平均癫痫发作等级略高于VPA组,比较Mus组和VPA组的癫痫发作等级,未见显著性差异。Flu组小鼠海马的KLF4表达显著低于VPA组,而比较Mus组和VPA组,未见显著性差异。KLF4抗癫痫作用的机制初步探讨方法:选取32只健康ICR小鼠,随机分为saline+lv-GFP组,PTZ+lv-GFP组,saline+lv-KLF4组和PTZ+lv-KLF4组。定位向小鼠海马注射以慢病毒为载体的KLF4过表达病毒和对照病毒,注射病毒后待表达三周,建立海马KLF4过表达小鼠模型。按照分组给予PTZ腹腔注射,观察并记录给药后20 min内小鼠癫痫行为的变化。并利用免疫荧光染色的方法,观察各组小鼠海马和梨状皮层的c-Fos表达变化。结果:1.PTZ+lv-KLF4组小鼠较PTZ+lv-GFP小鼠的癫痫发作潜伏期显著延长,同时其组内小鼠的平均发作等级也显著降低。2.PTZ给药后小鼠海马和梨状皮层的c-Fos表达显著增多。比较PTZ+lv-KLF4组和PTZ+lv-GFP组小鼠发现,PTZ+lv-KLF4组小鼠海马和梨状皮层的c-Fos表达量显著减少。KLF4对戊巴比妥诱导的小鼠睡眠活动的影响方法:1.选取16只健康ICR雄性小鼠,随机分为对照组和戊巴比妥(Pentobarbital,PBBT)组。通过免疫印记的方法对给药后小鼠海马KLF4表达进行测定。2.选取32只健康ICR小鼠,随机分为PBBT+lv-GFP组、PBBT+lv-KLF4组、PBBT+si-GFP组和PBBT+si-KLF4四组。定位向小鼠海马注射以慢病毒为载体的KLF4过表达病毒和KLF4干扰表达病毒,及相应的对照病毒,待表达三周后,按照分组给予戊巴比妥腹腔注射,观察并记录给药后小鼠睡眠行为的变化。结果:1.急性戊巴比妥腹腔注射后,小鼠海马KLF4的表达量较对照组显著升高。2.lv-KLF4组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时间都较对照病毒组没有统计学差异。si-KLF4组小鼠的睡眠潜伏期较对照病毒组显著延长。同时,其睡眠时间较对照病毒组显著减少。结论:1.丙戊酸钠和卡马西平的抗癫痫作用与促进海马KLF4表达有关。2.氟马西尼能够通过抑制丙戊酸钠上调KLF4的作用,拮抗其抗癫痫效应。3.KLF4可能通过抑制戊四唑诱导的小鼠海马和梨状皮层c-FOS表达,发挥其抗癫痫作用。4.KLF4能够参与戊巴比妥诱导的睡眠活动的调控。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.1
【图文】：

腹腔注射,海马,条带,对照组

24图 2.2 PTZ 腹腔注射对 KLF4 表达的影响（A）海马 KLF4 表达量（B）海马 KLF4 表达条带。注：*P<0.05，与对照组比较。

癫痫发作,抗癫痫药物,小鼠,腹腔注射

CBZ 腹腔注射组较 PTZ 组均能够显著降低癫痫发作等级（P<0.001）。VPA 灌胃组对癫痫发作潜伏期和发作等级的影响较 CBZ 腹腔注射组更显著（P<0.01）。表 2.1 不同抗癫痫药物对小鼠阵挛性发作潜伏期和发作等级的影响组别动物数阵挛性发作潜伏期（s）平均发作等级PTZ 8 92.75±7.34 4.75±0.16PTZ+VPA 8 232.50±19.66*** 1.5±0.27***PTZ+CBZ 8 176.00±21.36**,#2.50±0.33***,#注：数据用平均值±标准误差(Mean±SE)表示，PTZ: 65 mg/kg, i.p. ；VPA：400mg/kg, p.o. ；CBZ：10mg/kg i.p.；**P<0.01 与 PTZ 组比较；***P＜0.001 与 PTZ 组比较；#P<0.05 与PTZ+VPA 组比较

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