基于光纤光度测定法研究痫样钙活动与光解Rubi-GABA抑制发作

发布时间：2020-07-01 07:51

【摘要】：研究目的癫痫是一种多病因的脑功能障碍综合征,以群体神经细胞反复自发的异常同步放电为特征。随着近些年钙成像技术的不断发展,基于钙超载假说的癫痫基础研究也越来越多。本文以癫痫发生的钙超载假说为依据,利用光纤光度测定方法(Fiber photometry),记录由4-AP(4-aminopyriding)或KA(Kainic acid)给药诱导自由活动小鼠出现的癫痫样钙信号,分析癫痫样钙信号与行为学发作之间的相关性,并研究局部光解抑制性神经递质GABA的光敏复合物(Rubi-GABA)对行为学发作及与发作相关的癫痫样钙信号的影响。研究内容1.初级运动皮层4-AP局部给药诱发的癫痫样钙信号记录及特征分析,异常钙信号与行为学发作之间相关性的研究;2.研究在海马CA1局部光解GABA笼状复合物Rubi-GABA对KA诱导的急性痫样发作和癫痫样钙信号钙信号的影响。研究方法1.实验对象和分组:选择2月龄的雄性C57BL/6小鼠为研究对象;对于4-AP局部诱发部分,实验分为ACSF组、1m M 4-AP和10m M 4-AP组;对于光解笼锁Rubi-GABA抑制发作实验部分,实验分为KA组、KA+Saline组和KA+Rubi-GABA组;2.急性癫痫样发作的诱导方法与行为学评分标准:1)局部诱发:在小鼠的初级运动皮层(Primary motor cortex,M1)局部滴加1m M或10m M的4-AP溶液;2)全身系统给药:皮下注射20mg/kg剂量的KA溶液。录制小鼠在给药前后的行为学视频,按照改进的瑞辛法则对小鼠行为进行评分,III级至V级的发作称为惊厥性运动发作(Convulsive motor seizure,CMS);3.钙信号记录:对实验动物行开颅手术后,通过多细胞大剂量注射(Multicell bolus loading,MCBL)方法在目标脑区M1、CA1和EC(Entorhinal cortec,EC)加载钙离子指示剂(Oregon green BAPTA-1 AM,OGB-1 AM),并植入光纤收集荧光信号;4.光解Rubi-GABA:对于光解Rubi-GABA实验部分,提前给小鼠CA1预埋用于药物注射和光纤埋置的导管,搭建用于光解Rubi-GABA的光纤耦合光路,调节光纤端面的输出功率为10m W;5.钙信号分析和统计学处理方法:利用基于Lab VIEW编写的钙信号分析软件读取和分析实验所得的钙信号,其幅值用△F/F表示。对4-AP或KA给药前后的钙信号进行配对样本的非参数t检验;对其他组进行单因素方差检验。研究结果1.4-AP局部给药诱发的癫痫样钙信号:a)与麻醉状态下节律性的自发钙活动相比,4-AP局部给药会诱发M1出现异常的钙波,对照组、1m M 4-AP组和10m M 4-AP组特征钙信号的幅度统计值分别为2.87±0.08%、3.93±0.22%和10.02±0.62%;b)与清醒条件下的自发钙活动相比,4-AP会诱导M1出现异常的钙波,伴随高频震荡,对照组、1m M 4-AP组和10m M 4-AP组特征钙信号的幅度统计值分别为2.82±0.24%、4.18±0.38%和6.77±0.47%。2.局部光解笼Rubi-GABA对痫样发作的抑制作用:a)KA全身给药(20mg/kg,s.c.)会诱导小鼠出现急性癫痫样发作,海马CA1的钙信号表现为三种类型:KA-I型钙波(KA-wave1)、KA-II型钙波(KA-wave2)和KA-低频脉冲钙活动(KA-slow flash)。b)在海马CA1局部光解Rubi-GABA可以缓解KA诱发的急性癫痫样发作,包括发作等级由V变成II级,癫痫样钙信号频率变低。结论1.4-AP局部注射会诱发M1出现与自发活动具有显著差异的癫痫样钙活动,4-AP浓度越高,癫痫样钙信号幅度越大,神经细胞异常兴奋的同步性越强;2.皮下注射KA可以诱导小鼠出现急性癫痫样发作,在行为学发作前海马CA1已经形成了异常的癫痫样钙活动,表现为异常同步的伴随高频脉冲样信号的钙波;3.小鼠自由活动时,在海马CA1局部光解Rubi-GABA可以改善KA诱导的急性痫样发作和癫痫样钙活动。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.1
【图文】：

用户指南,前面板,模块

精度电子天平称取 1.88mg 的 4-AP 粉末（A78403，Sigma），中，充分混匀，配置 4-AP 浓度为 20mM，随后分装在 0.2ml℃保存。工作浓度分别为 1mM 和 10mM。验原理钙信号采集的光纤光度测定技术M-02M FiberOptoMeter 设备是苏州国科医疗委托德国 npi Elect的一款可同时用于光刺激和荧光测量的工具。FOM-02M 模块现两种不同波长的光刺激，同时可以利用同一根光纤进行荧电倍增管将光信号转换成电信号。光纤通过 FC/PC 连接头连中的FIBER OUT输出端口。本研究中使用神经元Ca2+信号记录2.3A所示。Ca2+指示剂OGB-1AM在波长488nm处被固态激光荧光。光纤尖端的光强约为 20~30μ 。该记录系统使用基于自定义软件（National Instruments，Austin，TX，USA）对激采集进行管理。

测定技术,钙信号,固态激光器,用户指南

2+信号记录的部分，原理如图2.3A所示。Ca2+指示剂OGB-1AM在波长488nm处被固态激光器激发，发出绿色荧光。光纤尖端的光强约为 20~30μ 。该记录系统使用基于 LabVIEW平台上的自定义软件（National Instruments，Austin，TX，USA）对激光开/关控制和数据采集进行管理。图 2.2 FOM-02M 模块前面板（引自 FOM-02M 用户指南中文版）

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