血管生成素-2（Angiopoietin-2）调节小鼠下肢缺血血管生成的研究

发布时间：2020-07-06 23:36

【摘要】：目的:研究血管生成素-2(Angiopoietin-2)在下肢缺血模型的实验小鼠中,对缺血部位血管生成的作用机制。方法:1.建立C57/B L6小鼠下肢缺血模型及腹腔给药:麻醉实验小鼠后,经股深动脉下缘和乆动脉上缘结扎实验小鼠左侧股动脉干支,并且离断双结之间股动脉干支,缝合皮肤,复温后,应用激光多普勒仪记录实验小鼠双下肢血流灌注情况,在结扎前(pre),1d,3d,5d,8d,各记录一次血流情况。计算左腿与右腿的血流比值,即结扎侧与非结扎侧的比值。将实验小鼠分为两组,对照组和给药组,各组为3只实验小鼠,对照组经腹腔注射给予等量的生理盐水,给药组腹腔注射重组人血管生成素-2(recombination-human-Ang-2),在结扎日(1d),3d,5d,各给药一次。在第8d处死实验小鼠,经下腔静脉取抗凝血,离心,取上清液;取双侧下肢肌肉,包括内收肌和腓肠肌。2.ELISA法检测血清中rh-Ang-2的含量:取实验小鼠离心后的血清,按ELISA试剂盒操作说明检测血清中rh-Ang-2的含量。3.实时荧光定量PCR分析待测组织样品中目的基因的表达:用液氮研磨实验小鼠肌肉组织,用t rizol裂解研碎的组织,传统法抽提总RNA,琼脂糖凝胶电泳分析所提RNA质量,逆转录合成cDNA,实时荧光定量PCR仪分析目的基因的表达,包括Ang-1,Ang-2,PDGF-BB,PDGFR-β,VEGF-A,VEGF-C。4.应用免疫荧光法分析小鼠肌肉血管生成情况:取小鼠下肢肌肉,以4%多聚甲醛固定,送病理科以石蜡包埋,并制成病理切片,用anti-α-sma做免疫荧光分析,靶向标记血管周细胞,计算新生血管的平均管径。5.体外血管平滑肌细胞培养研究ang-2对pdgf-bb信号通路的影响:用培养皿培养人脐静脉血管平滑肌细胞(huvsmc),设置4各组,分别为空白组(control),ang-2组,pdgf-bb组,ang-2+pdgf-bb组,在无血清培养基情况下,在各组中加入对应处理因素,分别做了细胞划痕实验和蛋白质印迹实验。6.统计方法:采用spss17.0软件进行单因素方差分析,p0.05为差异具有统计学意义。结果:1.ang-2对下肢缺血小鼠模型血流灌注恢复情况的影响:对照组实验小鼠内收肌血流自结扎日起,血流逐渐增大,而ang-2组血流增加不明显;而相比腓肠肌血流变化,对照组与ang-2组无明显差异。2.血清elisa结果显示,对照组血清rh-ang-2未检出,ang-2组血清中检出rh-ang-2。3.实时荧光定量pcr结果显示,ang-2组实验小鼠缺血测内收肌中,促血管生长因子ang-1,ang-2,pdgf-bb,vegf-a,vegf-c的表达量下降。4.免疫荧光显示ang-2组实验小鼠下肢缺血测内收肌平均血管管径小于对照组。5.细胞划痕实验显示,pdgf-bb组划痕距离恢复最快,ang-2+pdgf-bb次之,ang-2最慢,ang-2阻止pdgf-bb诱导的血管平滑肌细胞迁移;蛋白质印迹实验显示,ang-2+pdgf-bb组中pdgfr-β受体的磷酸化被抑制,表明ang-2阻止pdgf-bb增加的pdgfr-β受体的磷酸化。结论:1.ang-2减少下肢缺血灌注,抑制内收肌血管的生成与成熟,对腓肠肌血管新生的影响不明显。2.rh-Ang-2不存在于对照组小鼠中,而存在于给药组实验小鼠血清中,并影响其血管生成。3.Ang-2下调了内收肌血管生成中促血管因子Ang-1,Ang-2,PDGF-BB,VEGF-A,VEGF-C的表达。4.Ang-2抑制缺血测内收肌平均血管管径的增大。5.Ang-2减弱或者抑制了P DGF-BB/PDGFR-β信号通路。
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【图文】：

图 2. Ang-2 减少小鼠下肢血流灌注：在一周时间内，C57/BL6 小鼠下肢缺血模型，激光多普勒扫描显示 Ang-2 减少小鼠内收肌肉血流灌注，但对腓肠肌影响不大。A，代表性的小鼠内收肌血流变化图。B,小鼠内收肌血流恢复比较，*P<0.05，n=3/组。C，代表性的小鼠腓肠肌血流变化图。D，小鼠腓肠肌血流恢复比较。Fig2. Ang-2 reduces blood flow perfusion in a mouse hindlimb ischemia model. in a week time, Ang - 2 reduces blood flow perfusion inischemic adduction muscles, but not gastrocnemius muscles followed Color Laser Doppler Scanner. A . Representative images ofadductor muscle blood flow changes in mice. B. The curve of blood flow recovery of ischemic adductor muscles, * P < 0.05 Vs. vehicle,n=3/group. C. Representative images of the gastrocnemius muscle in mice blood flow changes. D. The curve of blood flow recovery ofischemic gastrocnemius muscles.2. 血清 ELISA 结果按照 human-Ang-2 ELISA 试剂盒的操作说明，检测两组小鼠血浆中 rh-Ang-2 的含量。其中，对照组未检测出 rh-Ang-2，Ang-2组 3 个小鼠均检测出 rh-Ang-2，其含量分别为 89.908pg/ml，

四川医科大学硕士学位论文 3. 实时荧光定量 PCR 扩增效果及分析目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF-B 和参基因 GAPDH 的扩增曲线表明，目的产物均得到了充分的扩增。在实验研究中，目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF和内参基因 GAPDH 的溶解曲线和扩增曲线均符合实验要求（见图 到图 9B）。

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本文编号：2744299