心肌细胞TLR4促进心梗后心脏炎症反应的研究

发布时间：2020-07-18 15:06

【摘要】：目的慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的一个重要病理特征是系统炎症反应(systemic inflammation),表现为循环血中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白介素(interleukin,IL)等炎性因子持续增多。这种炎症反应的来源广泛,包括心脏自身,也包括肝、肺、血管内皮、循环血中的白细胞等。就心脏而言,其中任何类型的细胞均可能作为炎症反应的来源。有研究表明,浸润心肌的白细胞以及心脏自身的成纤维细胞是心脏炎症反应的来源,而心肌细胞在CHF炎症反应中的作用及机制尚不明确。文献资料以及我们课题组的前期工作表明,心肌细胞可表达特定类型的免疫受体,例如toll样受体(toll-like receptors,TLR),这些免疫受体具有介导炎症反应的特性,如果被激活,则很可能使心肌细胞成为“炎性细胞”。有资料表明,心衰心脏中TLR4表达升高,但是没有明确心肌细胞TLR4表达是否升高;再者,CHF心肌细胞TLR4的功能状态如何尚未见研究,其是否具有不同于正常心肌细胞TLR4的致炎效应仍属未知。为了揭示CHF心脏中的心肌细胞是否扮演“炎性细胞”角色,并探讨该“炎性”角色是否源于其中TLR4的表达量和致炎效应增强,本课题利用大鼠心肌梗塞所致CHF模型,研究TLR4在心梗后CHF心肌细胞中的表达水平、与配体的结合能力以及介导炎症反应的能力,以明确心肌细胞TLR4是否促进CHF心脏炎症反应的发生。方法雄性成年SD大鼠45只,全麻下开胸结扎左冠状动脉前降支,造成心肌梗塞(myocardial infarction,MI);假手术动物经受相同手术过程,但不作结扎。心梗后4周,行心脏超声检测,确认心功能障碍,即表明CHF。将心梗后CHF大鼠过量麻醉致死,进行以下检测:(1)取血清,ELISA法测定BNP。(2)取缺血区和远端区心肌,分别用real time RT PCR和Western blot法测定心肌组织TLR4 m RNA和蛋白含量。(3)用多聚甲醛固定心脏,按常规行石蜡包埋和切片,用免疫组化法检测心肌细胞TLR4的分布和表达水平。(4)取心脏,用Langendorff装置经主动脉逆行灌流II型胶原酶,消化分离并收集心肌细胞。用real time RT PCR法测定心肌细胞TLR4以及炎症因子IL 6和TNF α的m RNA含量,用Western blot法测定蛋白含量;用ELISA法测定炎症因子IL 6和TNF α的蛋白含量;用免疫荧光细胞化学法检测心肌细胞TLR4的分布和含量;用带有荧光分子标记的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)配体LPS(lipopolysaccharide)和损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern,DAMP)配体HSP60(heat shock protein 60k D)分别与心肌细胞共孵育,以结合并激活心肌细胞内的TLR4,通过结合的荧光强度分析心肌细胞TLR4与PAMP和DAMP配体的亲和力,并通过炎症因子表达和释放量分析心肌细胞TLR4的致炎效应。结果1.心梗后CHF大鼠模型的建立在心梗后4w,心超测得CHF组左心室舒张末和收缩末内径均显著大于假手术组,左心室缩短分数均低于20%(平均15.6±4.2%),且左心室前壁运动明显减弱、部分动物左心室后壁运动也减弱;血清BNP检测显示CHF组BNP显著高于假手术组;心肌切片HE染色显示CHF心腔明显扩大,缺血梗死区见大量炎性细胞浸润。上述结果表明心梗后4w动物发生了CHF。2.心梗后CHF大鼠发生了心脏炎症反应及全身炎症反应在心梗后CHF大鼠心脏,缺血梗死区及远端区炎症因子TNFa和IL-6的m RNA和蛋白表达量均显著升高;CHF组血清TNFa和IL-6蛋白含量显著高于假手术组;在急性消化分离的心肌细胞,CHF组心肌细胞TNFa和IL-6的m RNA和蛋白表达量均显著高于假手术组。以上三项结果表明,心梗后CHF大鼠发生了心脏炎症反应及全身炎症反应。3.在心梗后CHF状态下,心肌细胞TLR4的m RNA及蛋白表达量均增加(1)在心梗后CHF心脏,缺血梗死区及远端区TLR4的m RNA和蛋白表达量均显著升高;免疫荧光组织化学显示假手术心肌TLR4阳性信号呈斑片状分布,而CHF心肌TLR4阳性信号分布更广泛、且强度更高,主要分布于梗死周边区和远端区的心肌细胞,浸润心肌的白细胞则基本检测不到TLR4阳性信号。(2)从CHF心脏急性消化分离心肌细胞,免疫荧光细胞化学显示TLR4阳性信号增强,该阳性信号主要分布于细胞膜,而胞浆内分布相对较少且不均一。(3)从CHF心脏急性消化分离心肌细胞,其TLR4的m RNA和蛋白含量均显著高于假手术组心肌细胞。以上结果表明,CHF心肌细胞TLR4的表达量上调。4.CHF心肌细胞的TLR4与PAMP和DAMP配体分子的最大结合能力增强从心梗后CHF心脏消化分离出心肌细胞,与TLR4特异性PAMP配体LPS或者DAMP配体HSP60共孵育(LPS和HSP60均带有荧光探针标记),在激光共聚焦显微镜下观察到CHF心肌细胞与LPS和HSP60的结合荧光均增强,且anti-TLR4抗体预处理显著减少LPS和HSP60与心肌细胞的结合。依据荧光强度值拟合的结合曲线显示,CHF心肌细胞TLR4与LPS和HSP60的最大结合能力(maximum binding capacity,Bmax)均增加,而解离常数(dissociation constant,Kd)则没有明显改变;此外,结合曲线也显示anti-TLR4抗体预处理使得LPS和HSP60与心肌细胞的结合量显著下降。上述结果表明,CHF心肌细胞TLR4与PAMP和DAMP配体分子的最大结合能力增强。5.CHF心肌细胞的TLR4具有致炎效应从心梗后CHF心脏消化分离出心肌细胞,分别给予TLR4特异性PAMP配体LPS或者DAMP配体HSP60进行刺激,检测到大量炎症因子被诱导产生,TNFa和IL-6表达和释放量均显著高于假手术组心肌细胞;用TLR4抗体封闭后,LPS和HSP60诱导产生的炎症因子大幅减少。该结果表明,CHF心肌细胞TLR4促进心肌炎症反应。结论本研究结果显示:心梗后CHF心脏的心肌细胞TLR4表达上调,心肌细胞TLR4与PAMP和DAMP配体的结合能力增强,促炎作用也增强。该结果表明,心肌细胞TLR4受体表达和功能上调是CHF心脏炎症反应的重要来源。心肌细胞不同于免疫细胞,通常不被认为具有致炎效应,本工作表明,心肌细胞在CHF状态下可成为“炎性细胞”,在心肌细胞表达的TLR4受体可参与诱导心肌炎症反应。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2;R541.6
【图文】：

炎症反应,慢性心衰,大鼠心肌细胞,大鼠

29炎症反应。(A)心肌梗死区和远端区的 TNFα 和 I区的 TNFα 和 IL-6 蛋白水平。 (C) sham 和 CH(D)分离的 sham 和 CHF 大鼠心肌细胞中 TNFα 和 CHF 大鼠心肌细胞中 TNFα 和 IL-6 蛋白含量。空心ata are means ± SD. n = 4~6/group. *P < 0.05,

慢性心衰,远端,黄色的,免疫组织化学染色

32D图3 慢性心衰大鼠心肌TLR4的表达增加 (A) sham和CHF大鼠心肌缺血区和远端区TLR4mRNA 水平(n = 6/group)。(B)代表性的 western blot 图像和(C) sham 和 CHF 大鼠心肌缺血区和远端区 TLR4 蛋白定量(n = 4/group)。(D)代表性的心脏切片 TLR4 (green) 和CD45 (red)免疫组织化学染色图。黄色的方框表示右侧被放大的区域。(Data are means± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. respective sham.)Asham CHF infarct CHF remote 1

心肌细胞,结合能力

图 5 CHF 心肌细胞中 TLR4 与 LPS 和 HSP60 的结合能力增强。分离的心肌细胞在 37°C的 CO2孵箱中孵育 24h 后，在 4°C 孵育使其结合反应 30min。培养的心肌细胞用 TLR4中和抗体 (anti-TLR4, 5 μg/ml) 在 37°C 孵育 15min 以封闭 TLR4，接着在 4°C 孵育FITC-LPS 或 OG-HSP60 30min。(A)分离的细胞孵育 FITC-LPS (green) 或 OG-HSP60(green)后的代表的荧光图像。(B)FITC-LPS 与心肌细胞的结合曲线。(C)OG-HSP60 与心肌细胞的结合曲线。

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