酪氨酸激酶c-Src在机械通气肺损伤中的作用机制

发布时间：2017-03-30 19:27

  本文关键词：酪氨酸激酶c-Src在机械通气肺损伤中的作用机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的：机械通气相关肺损伤(Ventilation induced-lung injury, VILI)是指在利用呼吸机进行机械通气时,由于机械通气的原因和肺部原发病交叉引起的急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)。机械因素通过破坏肺泡细胞膜的完整性,影响细胞膜的通透性,引起肺泡水肿,进而引起肺损伤。致密连接蛋白(Tight junctions, TJs) Occludin是维持肺泡上皮通透性和屏障功能的重要连接蛋白。因此,本研究通过体外实验(周期性机械牵张小鼠肺泡上皮细胞)和体内实验(不同潮气量机械通气)来模拟机械通气相关肺损伤,观察致密连接蛋白Occludin和酪氨酸激酶c-Src的表达；使用c-Src激酶抑制剂后,Occludin蛋白表达的变化及c-Src激酶磷酸化状态,及c-Src激酶在VILI中的作用机制。研究方法：体外实验：将单层培养的小鼠肺泡上皮细胞(MEL-12细胞)随机分为5组,对照组(C组)、机械牵张组(S组)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)组(D组)、酪氨酸激酶(c-Src)抑制剂(PP2)组(P组)、小分子RNA干扰(siRNA-Occludin)组(Si组)。D组、P组在进行周期性机械牵张前30min用c-Src激酶抑制剂PP2 (100umol/L)和DMSO (30ul/ml)进行预处理。C组未进行周期性机械牵张；S组以频率0.5HZ,牵张幅度为8%、20%分别进行周期性机械牵张MLE-12细胞,D组、P组以频率0.5HZ,牵张幅度20%进行周期性机械牵张预处理后的MLE-12细胞,S组的牵张时间时间为1 h、2 h、4 h,D组、P组的机械牵张时间为4 h。Si组进行siRNA-Occludin预处理。预处理及周期性机械牵张后,一部分在冰上迅速进行蛋白裂解,提取总蛋白,用于Western Blotting检测Occludin蛋白及c-Src激酶的表达；另一部分,用4%多聚甲醛固定l0min,透膜封闭后,采用细胞免疫荧光观察Occludin蛋白的分布。体内实验：30只健康Wistar大鼠,体重250-300g,随机分为5组,每组6只：对照组(C组),小潮气量组(M组),大潮气量组(H组),小潮气量+c-Src激酶抑制剂组(M+P组),大潮气量+c-Src激酶抑制剂组(H+P组)。C组大鼠不进行机械通气；M组、H组、M+P组、H+P组均进行机械通气,呼吸频率均为40次／min,吸呼比(I：E)为1：2,吸入氧浓度为21%,通气时间为4h。M组和M+P组潮气量为7mL/kg; H组和H+P组潮气量为42mL/kg。M+P组和H+P组在麻醉前用c-Src激酶抑制剂PP2 (lug/kg)预处理1h。机械通气后,记录肺损伤评分；右肺上叶迅速放入液氮中,冻存备Western Blotting测Occludin蛋白及c-Src激酶；右肺其他部分固定于4%多聚甲醛中,做HE染色；左肺用来测干湿重比评价肺水肿(W/D)。结果：体外实验：1.免疫荧光发现,牵张幅度20%的周期性机械牵张,Occludin表达呈时间依赖性,随牵张时间的增长,Occludin表达减少,PP2预处理后,进行机械牵张,Occludin表达较未用PP2预处理多。2. Western Blotting发现,S组中牵张幅度为8%的周期性机械牵张1h、2h、4h,与牵张0h相比,Occludin表达没有明显变化(P0.05)；S组中振幅为20%的周期性机械牵张1h、2h、4h,与牵张0h相比,c-Src激酶表达明显升高(P0.05),Occludin表达明显降低(P0.05)；与S组中机械牵张4h比较,D组中机械牵张4h的Occludin没有明显改变(P0.05)；与S组中机械牵张4h比较,P组中机械牵张4h, Occludin表达升高(P0.05)。体内实验：1.HE染色发现,大潮气量机械通气肺泡充血严重,出血,肺泡壁增厚,肺透明膜形成；加入PP2后进行大潮气量机械通气后,肺泡充血及出血减少,肺泡壁增厚减少；小潮气量机械通气肺泡变化不明显；2. Western Blotting发现,与C组及M组比较,H组Occludin蛋白表达降低(P0.05),总的和磷酸化的c-Src激酶表达均升高(P0.05)；与H组比较,H+P组Occludin蛋白表达升高(P0.05),总的和磷酸化的c-Src激酶表达均降低(P0.05)。结论：大潮气量机械通气导致机械通气肺损伤,可能与酪氨酸激酶c-Src有关。c-Src激酶磷酸化导致c-Src激酶激活,c-Src激酶激活导致致密连接蛋白Occludin表达降低,导致肺损伤。
【关键词】：机械通气相关肺损伤 周期性机械牵张 致密连接蛋白 c-Src激酶 Occludin
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 符号说明13-14
• 前言14-18
• 参考文献16-18
• 第一部分 机械牵张对细胞凋亡及致密连接蛋白Occludin表达的影响18-34
• 材料与方法19-27
• 结果27-28
• 讨论28-29
• 结论29-30
• 附图30-32
• 参考文献32-34
• 第二部分 酪氨酸激酶Src在机械通气性牵张致肺泡上皮细胞损伤中的作用34-46
• 材料与方法35-39
• 结果39-40
• 讨论40-41
• 结论41-42
• 附图42-44
• 参考文献44-46
• 第三部分 酪氨酸激酶Src大鼠机械通气相关性肺损伤中的作用46-60
• 材料与方法47-52
• 结果52-53
• 讨论53-55
• 结论55-56
• 附图56-58
• 参考文献58-60
• 综述60-69
• 参考文献66-69
• 致谢69-70
• 攻读硕士学位期间发表的论文目录70-71
• 附件71

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  本文关键词：酪氨酸激酶c-Src在机械通气肺损伤中的作用机制，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：277924